乳腺癌中Nestin與CD133的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

黃思念，程美紅 ，譚云山，姚俊霞，靖紅艷

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院病理科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032）

乳腺癌中Nestin與CD133的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

黃思念1，程美紅1，譚云山2，姚俊霞1，靖紅艷1

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院病理科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032）

目的 探討乳腺癌中巢蛋白(Nestin)與CD133的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)系。方法 收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院2010年1月至2013年6月67例乳腺癌病理標(biāo)本，使用免疫組織化學(xué)染色，觀察Nestin、CD133與E-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)。結(jié)果 Nestin的總體陽性率為73.13%(49/67)，CD133的總體陽性率為40.30%(27/67)。Nestin在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率分別為90.48%(19/21)和65.22%(30/46)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而CD133的分別為71.43%(15/21)和26.09%(12/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Nestin和CD133在E-cadherin陰性組中的陽性率為95.83%(23/24)和58.33%(14/24)，高于在E-cadherin陽性組中的60.47%(26/43)和30.23%(13/43)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 Nestin能夠用以特異性檢測乳腺癌干細(xì)胞的表達(dá)，CD133能夠用以特異性檢測三陰性乳腺癌中干細(xì)胞的表達(dá)，乳腺癌組織表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。

乳腺癌；三陰性乳腺癌；巢蛋白；CD133；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

近年來乳腺癌干細(xì)胞與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)關(guān)系的研究給乳腺癌的治療提供了新的方向。EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型的一種去分化現(xiàn)象，是有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)獲得侵襲性和遷移能力[1]。有研究者發(fā)現(xiàn)，通過外界刺激，乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，開始表達(dá)間質(zhì)表型，同時(shí)獲得自我更新能力和干細(xì)胞表型[2]。傳統(tǒng)的乳腺癌干細(xì)胞研究一般選用CD44+/CD24-/low作為干細(xì)胞標(biāo)記，而進(jìn)一步的研究顯示CD44+/CD24-/low的乳腺癌細(xì)胞群存在異質(zhì)性，其篩選出來的干細(xì)胞還可以細(xì)分為不同的亞群，有些細(xì)胞亞群并沒有形成腫瘤的能力，提示用該分子標(biāo)記篩選出的細(xì)胞不完全是乳腺癌干細(xì)胞[3]。因此有必要篩選其他的干細(xì)胞標(biāo)記或聯(lián)合運(yùn)用多種干細(xì)胞標(biāo)記用于乳腺癌干細(xì)胞的研究。巢蛋白(Nestin)作為一種干細(xì)胞標(biāo)記，多表達(dá)于一些神經(jīng)源性腫瘤中，其表達(dá)提示腫瘤的惡性程度和侵襲性更大[4]。而CD133是一種位于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，其表達(dá)水平隨著細(xì)胞的成熟分化迅速下調(diào)，可以分離和鑒定干細(xì)胞和祖細(xì)胞[5]。兩者能否作為一個(gè)新的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記，成為干細(xì)胞治療的靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步的研究。

三陰性乳腺癌是一類對(duì)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(Her-2)三種蛋白均不表達(dá)的乳腺癌亞型。三陰性乳腺癌不能從內(nèi)分泌和靶向治療中獲益，預(yù)后較差，是臨床治療的難題。三陰性乳腺癌對(duì)治療的抵抗性是否與其存在較高的乳腺癌干細(xì)胞比例有關(guān)，尚未得到深入研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院2010年1月至2013年6月的67例乳腺癌手術(shù)根治標(biāo)本，腫瘤直徑0.8～3.5 cm，術(shù)后病理檢查均為浸潤性導(dǎo)管癌，Ⅱ～Ⅲ級(jí)，所有標(biāo)本均已檢測ER、PR、Her-2、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察。所有標(biāo)本均采用免疫組化Envision二步法，使用Leica全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀操作，切片常規(guī)脫蠟，水化，常溫阻斷，抗原枸櫞酸鹽熱修復(fù)，一抗室溫孵育60 min，二抗室溫孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水，透明中性樹膠封片。一抗包括ER(工作濃度1:50)、PR(工作濃度1:50)、E-cadherin(工作濃度 1:150)，購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；Her-2(工作濃度1:100)、Nestin(工作濃度1:100)、CD133(工作濃度1:100)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DS9800(LEICA)為二抗，購自上海譽(yù)源醫(yī)療設(shè)備有限公司。用已知陽性切片作陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照Envision二步法。

1.3 陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Nestin和CD133陽性結(jié)果 Nestin陽性表達(dá)為胞漿出現(xiàn)棕黃色，使用陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比的方法分析結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)如下：Nestin陽性細(xì)胞百分比＜1%判讀為陰性；Nestin陽性細(xì)胞百分比≥1%判讀為陽性[6]。CD133陽性表達(dá)為胞膜出現(xiàn)棕黃色，使用陽性細(xì)胞數(shù)分析結(jié)果，選取4個(gè)陽性范圍最大的高倍視野(×400倍)，計(jì)數(shù)約200個(gè)細(xì)胞，CD133陽性細(xì)胞數(shù)＞10%判讀為陽性，≤10%判讀為陰性[7]。

1.3.2 ER、PR判讀標(biāo)準(zhǔn)[8]腫瘤細(xì)胞胞核有棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)少于10%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)大于10%判定為ER、PR陽性。

1.3.3 Her-2判讀結(jié)果 按照ASCO臨床實(shí)踐指南推薦的評(píng)分系統(tǒng)[9]：腫瘤細(xì)胞環(huán)繞胞膜有棕黃色顆粒為陽性，未觀察到著色或≤10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整著色為陰性；＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的著色或≤10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)完整著色判讀為++；＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)完整著色判讀為+++。我們在實(shí)驗(yàn)中將染色結(jié)果3++才判定為陽性。

1.3.4 E-cadherin判讀標(biāo)準(zhǔn)[10]腫瘤細(xì)胞胞核有棕黃色顆粒為陽性，≤50%判讀為陰性，＞50%判讀為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(Version 19.0，Chicago，IL，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 乳腺癌細(xì)胞完整環(huán)繞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為Her-2陽性，Envision二步法（×100）；圖2 乳腺癌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Nestin陽性，Envision二步法（×200）；圖3 乳腺癌細(xì)胞胞膜出現(xiàn)突出于背景的棕黃色顆粒為CD133陽性，Envision二步法（×200）

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 67例乳腺癌患者年齡36～92歲，平均64歲。三陰性乳腺癌21例，非三陰性乳腺癌46例。其中Her-2陽性患者12例，Her-2陽性表達(dá)為環(huán)周膜染色(圖1)。

2.2 Nestin和CD133在乳腺癌中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示Nestin陽性表達(dá)為細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖2)。Nestin在乳腺癌、三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率分別為73.13%(49/67)、90.48%(19/21)、65.22%(30/46)，Nestin在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示CD133陽性表達(dá)為細(xì)胞膜出現(xiàn)突出于背景的棕黃色(圖3)。CD133在乳腺癌、三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率 分 別 為 40.30%(27/67)、71.43%(15/21)、26.09%(12/46)，CD133在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中陽性率比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 乳腺癌中Nestin和CD133的表達(dá)與E-cadherin的關(guān)系 Nestin在E-cadherin陽性組和E-cadherin陰性組中的陽性率分別為60.47%(26/43)和95.83%(23/24)，兩組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CD133在 E-cadherin陽性組和 E-cadherin陰性組中的陽性率分別為30.23%(13/43)和58.33%(14/24)，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

近年來的研究表明，EMT和獲得干細(xì)胞表型之間似乎存在某種關(guān)聯(lián)，并形成了一個(gè)假設(shè)，即發(fā)生了EMT的腫瘤細(xì)胞通過獲得了類似于干細(xì)胞的自我更新的能力，同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記[2]。人體乳腺組織中顯示存在表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記Nestin的細(xì)胞，有研究在人體乳腺組織中分離出Nestin陽性的干細(xì)胞[11]。我們在實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到Nestin陽性的腫瘤細(xì)胞，其73.13%的陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記CD44+/CD24-/low 58.7%[12]的陽性率。Nestin在乳腺癌中的表達(dá)率較高，或許可以作為一個(gè)較敏感的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記。

Wright等[13]從乳腺癌細(xì)胞系中分選出表達(dá)CD133標(biāo)記的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞較不表達(dá)CD133的細(xì)胞具有更高的克隆能力和增殖活性，接種于免疫缺陷小鼠后具有更高的腫瘤形成能力，提示表達(dá)CD133的乳腺癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。本實(shí)驗(yàn)中干細(xì)胞標(biāo)記CD133陽性率為40.30%，與傳統(tǒng)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記陽性率相近，但其三陰性乳腺癌中的陽性率較非三陰性乳腺癌高。本研究與Lehmann等[14]的研究結(jié)果相似，他們通過對(duì)587例三陰性乳腺癌患者的基因分析，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌特異性表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記。在三陰性乳腺癌中，特異性表達(dá)CD133的癌細(xì)胞或許是乳腺癌干細(xì)胞。

有研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過EMT獲得干細(xì)胞樣特征，Salnikov等[15]在胰腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，低氧刺激細(xì)胞發(fā)生EMT，而發(fā)生EMT的細(xì)胞在干細(xì)胞標(biāo)記高表達(dá)的細(xì)胞中比例較高。高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，低表達(dá)或是不表達(dá)上皮標(biāo)記E-cadherin[15]。我們在乳腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，在本實(shí)驗(yàn)中，CD133、Nestin在E-cadherin陰性組中的陽性率均高于E-cadherin陽性組。發(fā)生EMT的腫瘤組織，細(xì)胞失去極性，出現(xiàn)E-cadherin表達(dá)的缺失。干細(xì)胞標(biāo)記CD133、Nestin在發(fā)生EMT的乳腺癌組織中表達(dá)率更高，提示乳腺癌組織表達(dá)干細(xì)胞表型可能與腫瘤組織發(fā)生EMT有關(guān)。

Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)，通過敲除Nestin基因，能明顯上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程。Nestin在乳腺癌中的表達(dá)率較高，通過抑制Nestin的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的EMT過程，或許可以成為靶向干細(xì)胞治療乳腺癌的新方向。而CD133在三陰性乳腺癌表達(dá)率較高，抑制CD133的表達(dá)，或許可以為三陰性乳腺癌的治療提供新方向。

綜上所述，Nestin可以用來特異性檢測乳腺癌干細(xì)胞的表達(dá)，而CD133可以用于特異性檢測三陰性乳腺癌中干細(xì)胞的表達(dá)。干細(xì)胞標(biāo)記CD133、Nestin在發(fā)生EMT的乳腺癌組織中表達(dá)率更高，提示腫瘤細(xì)胞可以通過EMT獲得干細(xì)胞樣特征。通過抑制Nestin的表達(dá)可能可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌的EMT過程，成為乳腺癌靶向干細(xì)胞治療的新方向。三陰性乳腺癌目前尚無相關(guān)靶向治療藥物，因此抑制三陰性乳腺癌中CD133的表達(dá)或許可以成為三陰性乳腺癌靶向治療的新方向。

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Relations between the expression of CD133,Nestin in breast cancer and epithelial-mesenchymal transition.

HUANG Si-nian1,CHENG Mei-hong1,TAN Yun-shan2,YAO Jun-xia1,JING Hong-yan1.1.Department of Pathology,Qingpu branch,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 201700,CHINA;2.Department of Pathology,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200032,CHINA

Objective To investigate the Nestin and CD133 expression in breast tumors and analyze the relationship between them and epithelial-mesenchymal transition(EMT).Methods A total of 67 samples of breast cancer were collected from Qingpu branch,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University from January 2010 to June 2013.Immunohistochemical staining was performed on these samples.Results Nestin expression was observed in 73.13%(49/67)cases.CD133 expression was observed in 40.30%(27/67)cases.Nestin expression in the triple-negative breast cancers was observed in 90.48%(19/21)cases,and Nestin expression in the other cancers was observed in 65.22%(30/46)cases,there was no significant difference between them(P＞0.05).CD133 expression in the triple-negative breast cancers was observed in 71.43%(15/21)cases,and CD133 expression in the other cancers was observed in 26.09%(12/46)cases,there was significant difference between them(P＜0.01).The expression rates of Nestin and CD133 in the E-cadherin-negative breast cancers were 95.83%(23/24)and 58.33%(14/24),which was significantly higher than 60.47%(26/43)and 30.23%(13/43)in the E-cadherin-positive breast cancers(P＜0.01).Conclusion Nestin might be a new sensitive marker for breast cancer stem cells.CD133 might be a new special marker for breast cancer stem cells.The higher expression of Nestin and CD133 in breast cancers that undergo EMT,which have demonstrated an association between EMT and acquisition of stem cells phenotype.

Breast cancer;Triple-negative breast cancers;Nestin;CD133;Epithelial-mesenchymal transition(EMT)

R737.9

A

1003—6350（2017）19—3099—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.002

上海市青浦區(qū)科委基金(編號(hào)：青科發(fā)2011-34)

程美紅。E-mail：45087556@qq.com

2017-04-10)