犬輸血安全及血型檢測問題探討

殷 珂 , 姜忠玲 ， 叢 霞 ， 曹榮峰 ， 田文儒 ， 李華濤

(青島農業大學動物科技學院 ， 山東 青島 266109)

犬輸血安全及血型檢測問題探討

殷 珂 , 姜忠玲 ， 叢 霞 ， 曹榮峰 ， 田文儒 ， 李華濤

(青島農業大學動物科技學院 ， 山東 青島 266109)

輸血可迅速補充循環血量和體液量，增加有效血容量，維持血壓，改善血液循環狀態；并增加機體血細胞，增強攜氧能力，同時增強機體抗感染能力和激發體內凝血因子及增強骨髓造血機能改善貧血等。大量臨床實踐表明，很多病例都需要輸血治療，例如急性失血、脫水導致大量體液喪失、血液寄生蟲病(牛蜱熱)、各種癥狀的貧血、中毒性休克、血友病、白血病及細菌或病毒引起的危重病例等。

但在我國動物疾病診療中，血液學和動物血庫方面的知識儲備很少，寵物主人對動物捐血或輸血治療的知識十分匱乏。一方面沒有定期具有身體健康合格的寵物捐血，另一方面也沒有為自己飼養的寵物檢測血型，一旦需要輸血時再來檢測血型，并且短時間內難找到需要的血型血液，往往會延誤治療。

1 動物輸血在我國動物疾病診療中存在的問題

1.1 急需建立動物血庫 輸血是現代外科手術、急救醫療以及某些疾病治療的重要一環。輸血成為常規醫療手段的前提是擁有經常性的用血儲備，亦即有血庫的存在。犬、貓作為人類的好朋友在人類生活中扮演著重要角色，在特殊條件下常需輸血急救。美國發達國家地區都有動物血庫，在中國香港2009年動物福利組織建立了首個動物血庫，但因場地和資金不足在2011年被迫關閉，目前國內尚無犬血庫。國內各地因輸血需求紛紛自發組織建立犬、貓等移動式寵物互助血庫，但由于多種因素導致很難維持。美國等發達國家和地區有專門的部門、機構建立動物血庫，為動物救治供血，我國只有部分動物醫院飼養供血動物。因此，中國急需建立一個動物血庫平臺，提高動物福利水平，提高人民幸福指數。

1.2 動物輸血應用存在風險問題 由于在中國還沒有可以利用的動物血庫平臺，同時也缺乏動物疾病診療中輸血用血液制品應用標準。各地的寵物醫院為了解決臨床中輸血難題，部分動物醫院自己飼養供血動物，以供輸血用。大大增加了因血型不合引起的輸血風險，引起寵物醫療糾紛，還能通過輸血傳播血液寄生蟲和傳染病。因此急需建立一套與血庫平臺配套的動物血液制品的質量評價標準和輸血技術的參考標準。

1.3 動物輸血急需解決的技術問題 動物血液資源庫和技術平臺：需要建立一套供血動物健康狀況的評價標準，主要針對供血動物血型、血液寄生蟲和傳染病的篩查，以及供血動物品種，年齡，體重的要求。建立一套采血，血液制品處理，保存的實驗室技術參考標準，以及針對動物用血液制品的質量評價標準。

動物輸血治療技術參數：急需制定一套輸血技術參考標準，制定主要針對血液制品的類型及輸液方式，所用輸血治療中的專用醫療耗材(輸血專用輸液器)，輸血前后的檢查和監測方法，出現輸血風險和緊急情況的處理方法和急救措施。

2 犬通過血液傳播的疾病及檢測方法

國際動物血液資源庫要求，所有提供犬輸血所用的血液制品，必須來源于經過全身體檢的犬，要求供血犬不含可以經過血液傳播的血液寄生蟲疾病。在中國寵物臨床中少數輸血案例中，均不進行這些項目的檢測，因此輸血醫療存在的風險也相對較大。此外，犬的傳染性疾病更為復雜，犬瘟熱等血液帶毒的疾病對輸血醫療也存在較大的風險。

對于犬瘟熱和細小病毒的檢測，在寵物臨床上應用較多的是膠體金檢測試紙，但在國內外也建立了多種分子生物學檢測方法，包括PCR、LAMP、熒光抗體等方法[1-3]。在中國2006年發現犬流感流暴發，國內外相繼也建立了PCR、RT-LAMP檢測方法用于犬流感病原的檢測[4]。

經媒介昆蟲傳播的血液寄生蟲疾病，國內針對不同的血液寄生蟲已經建立了很多相關的實驗室檢驗方法。針對犬惡絲蟲的有Dot-ELISA、PCR、ELISA、膠體金免疫試紙等檢測方法[5-7]。犬巴貝斯蟲有PCR、血涂片、免疫熒光鑒定方法[8-9]。現有的犬的無形體檢測手段僅僅是通過血涂片進行檢測但其靈敏度根本達不到臨床的需要。針對寄生蟲和細菌等引起的疾病在中國臨床檢測中的分類也很不清晰，很多時候均混為一談。大多認為是附紅細胞體或埃利希體疾病進行診治。但由于很多犬血液寄生蟲形態學相似，血涂片檢測會判斷不夠準確，免疫熒光的檢測可能會產生交叉反應出現非特異性的結果。因此對于很多類型的犬血液寄生蟲疾病，現有的檢測方法都滿足不了臨床檢測的要求。因此更特異、更靈敏、方便、便宜的臨床檢測急需要被建立起來。

3 犬血型分類及鑒定方法

3.1 犬血型的分類 犬的血型和人類的血型一樣，是具有種屬特異性和抗原性的紅細胞表面的遺傳標記，即犬紅細胞表面抗原，其實質多為糖蛋白。犬的紅細胞抗原種類繁多，血型分類也比較復雜。犬具有很多血型基因，每種血型基因獨立遺傳，相互之間互不影響，可以在同一犬的紅細胞上可以同時出現多種血型的組合。犬紅細胞表面抗原(DEA)，即血型系統是按照阿拉伯數字排序來分類的。

人們最初對犬血型的研究興趣主要是以犬作為動物模型研究輸血過程中產生的免疫反應而破壞紅細胞。Swisher等在1949-1961年第一次系統的研究了犬的血型[10-12]。隨后又報道了另外6種犬的血型系統[13-15]方面進行系統全面的闡述。至今為止，共描述了13種不同的犬血型系統，其中經國際標準確認的為8種[16-17]，分別為DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7、DEA8[18-19]。犬的血型鑒定在很多實驗室都是一個常規的服務項目，主要目的為了安全的輸血治療。

在DEA1.1系統中，至少有DEA1.1和DEA1.2兩種亞型，經研究確定其為等位基因。因此，犬DEA1.1和DEA1.2兩種血型抗原不能同時出現陽性和陰性。所有的DEA中，DEA1.1、DEA1.2和DEA7具有較強的免疫原性。其中DEA1.1和DEA1.2的抗原-抗體反應是導致急性輸血性溶血的最主要因素。現在報道犬的血型頻率的文章非常有限，有些血型很少見(比如DEA3)，。在所有的犬血型中，常見血型DEA4和DEA6出現率高達98%，DEA4和DEA6的抗原-抗體反應對輸血的紅細胞沒有任何影響(表 1)。所以，如果某只犬只有DEA4和DEA6，而沒有其他血型抗原，則可以作為萬能供血者。

在犬的血型系統中，不相容性的血液輸血后產生的溶血性輸血反應會比兼容性的血液快，會在輸血后4～5 d內產生溶血反應，因此被稱為遲發性溶血反應。相比急性溶血性輸血反應，它所帶來的后果并不嚴重，因此交叉配血在犬的首次輸血時其實并不需要。

表1 犬血型的基本情況

3.2 犬血型鑒定方法 近年來，輸血醫學在獸醫實踐中迅速增長，讓人們進一步認識了輸血前血型鑒定的重要性[20-21]，新的血型監測方法不斷涌現。科學家們依據紅細胞表面抗原在特異抗體存在時會發生紅細胞凝集的這一普遍原理，積極探索能夠引起特定抗原紅細胞凝集的凝集素，甚至研究過植物凝集素的分型效果。已報道的13種犬血型中，現在僅能夠買到5個血型系統的犬血型抗血清。國際上可以用多克隆抗血清進行血型鑒定的犬血型有DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7和DEA8，但是由于保存等原因，現在已經沒有DEA6和DEA8血型抗血清了[22]。Andrews等在1992年成功研制出了抗DEA1.1血型定型鼠單克隆抗體[23]。隨后，寵物血液庫等機構相繼推出了可以檢測DEA1.1和DEA1.2的血型試劑盒，可以輕易區分DEA1.1、DEA1.2和DEA1-，從而基本滿足了臨床上對血型測定的要求。

現在可用的動物血型分型的方法都是基于紅細胞抗原和單克隆試劑或多克隆血清的血凝反應原理實施的。在人類醫學中，血型檢測可以通過試管法、載玻片法、微孔板法和凝膠柱法進行鑒定。在獸醫臨床輸血治療中，血清學方法鑒定血型所用的方法和人類醫學相似，其中存在有試管法、卡片法和凝膠柱法等。商業化可用的針對犬和貓的血型檢測試劑，血型檢測卡在20世紀90年代面世并且不管在實驗室或臨床診療中都已經標準化，是惟一合理的可以用于犬血型檢測的方法，但對于犬的血型僅能夠測試DEA1.1血型并且犬中也有檢測錯誤的報道[24-25]。現在，作為替代方法的新型的凝膠柱凝集測試血型檢測方法可利用凝集反應來判斷血型的類型。目前廣泛使用的快速、簡便血型檢測方法就是血型檢測試劑盒，遺憾的是中國大陸還沒有開展血型檢測的業務。

在2005年，科學家分別對犬和貓比較了多種血型分型方法[24-25]。結果表明，這些不同的檢測方法具有良好的相關性，都能很好的檢測鑒定犬貓的血型。目前，發展犬血型基于DNA為基礎的PCR檢測方法很有必要。對犬血型的研究應該集中在血型基因型方面會更有意義。

經過血型鑒定后，為了進一步確定需要輸注的血液產品符合輸血的要求，需要做一個交叉配血實驗驗證供血犬血液和受血犬血液的相容性，驗證供血者和受血者之間的血清學是否兼容。在優化的歷程中包括多個快速檢測技術，如：試管法、凝膠柱法、載玻片、試管凝集、鹽水凝集、間接抗球蛋白試驗方法以及凝膠柱凝集方法。

3.3 制備犬血型單克隆抗體存在的技術問題 輸血前進行血型鑒定具有很重要的臨床意義。然而，犬的血型鑒定中缺乏相應的單克隆抗體，多克隆抗體的獲得也相當困難，需要進行大量血型已知的紅細胞樣本篩選才能夠確定是否可用。由于缺乏強有力的篩選方法，至今國際上存在的僅有Andrews等在1992年研制出了DEA1.1血型定型單克隆抗體，[23]要得到大量可以用于血型鑒定的單克隆抗體，必須解決抗體篩選方法的難題。而如今對犬的血型基因、蛋白結構等信息所知甚少。也無法純化得到較為單一的犬血型抗原。沒有單一的免疫原，也建立不了較為強大的Elsia篩選方法。用現在成熟的鼠單克隆抗體制備技術制備抗體，也是一個非常大的挑戰。

試劑紅細胞包括ABO反定型用的試劑紅細胞、各種紅細胞譜細胞(Panel cell RBC)及特殊或稀有血型紅細胞，用于血型鑒定、紅細胞血型抗體研究和檢查紅細胞抗體等方面，這些紅細胞血型抗原十分寶貴，也是難得的必備工作試劑[26]。所有的血型血清學實驗室都是必須常規配備的。目前，絕大多數血型血清學實驗室使用的試劑紅細胞，主要是全血經生理鹽水多次洗滌，再添加一定量的紅細胞保存液后而制成。目前反定型檢測使用試劑紅細胞，由于其易溶血、保存期短等原因，試劑質量難以保證，由此導致ABO血型反定型檢測至今未達到規范化、標準化。

現在技術中所建立的紅細胞抗體檢測方法和血型抗體篩選方法都避免不了用到試劑紅細胞但其不能夠長期保存，這樣進一步加大了血型抗體的篩選工作難度。大大限制了寵物醫療中輸血治療方法，急需研究出一個常規的方法，既可以長期保存血型抗原，又可以高通量的進行血型抗體的檢測，可以用多種犬的紅細胞來對多克隆抗體和單克隆抗體進行篩選。

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2017-01-16

國家自然科學基金(31502138，31572590)；山東省自然科學基金(BS2015NY001)；山東省高等學校科技計劃項目(J15LF03)

李華濤，E-mail:htli1986@hotmail.com