遼寧省豬鏈球菌病流行特征及其病原類型鑒定

董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彥林 ， 孫嘉一 ， 周鐵忠

(錦州醫科大學附屬動物醫院 ， 遼寧 錦州 121001)

遼寧省豬鏈球菌病流行特征及其病原類型鑒定

董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彥林 ， 孫嘉一 ， 周鐵忠

(錦州醫科大學附屬動物醫院 ， 遼寧 錦州 121001)

通過從遼寧省的遼東、遼南、遼西、遼北四個區域采集發病豬的淋巴結、脾臟、腦、關節液和膿腫液作為細菌學檢測病料，進行豬鏈球菌病的流行病學調查，以明確遼寧省豬鏈球菌病發生情況和特點，為進一步建立有效防治技術措施奠定基礎。同時對遼寧地區33株致病性豬鏈球菌，用分子生物學鑒定方法對特異性基因進行血清型鑒定,結果表明，遼寧省地區致病性豬鏈球菌主要以1、2、7型為主。

遼寧 ； 豬鏈球菌病 ； 流行特征 ； 病原類型

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起豬多種病理類型的傳染病。包括急性敗血型、化膿性淋巴炎型、腦膜炎型和關節炎型、心內膜炎等。豬鏈球菌根據菌體莢膜抗原性不同，分為35個莢膜血清型，其中豬鏈球菌1/2、1、2、7、9型具有致病性，致病性最強的是豬鏈球菌2型[1]。我國豬鏈球菌病發病持續上升，對我國養豬行業及相關從業人員造成了很大的傷害。2015年3月至2016年10月期間，從遼寧省的遼東、遼南、遼西、遼北4個區域采集發病豬的淋巴結、脾臟、腦、關節液和膿腫液作為細菌學檢測病料，進行了豬鏈球菌病的流行病學調查，以明確遼寧省豬鏈球菌病發生情況和特點，為進一步建立有效防治技術措施奠定基礎。同時遼寧省各地區該病發生普遍、病理類型復雜、防治效果不顯著，給當地養豬業帶來困擾，主要原因是對各地區豬鏈球菌的血清型、耐藥性等還缺乏系統研究[2]，沒有制定針對某一地區的防治方案。所以分區分時段采集樣品進行細菌的鑒定，以準確查明本地菌株的類型刻不容緩。因此，本試驗針對遼寧地區33株致病性豬鏈球菌，應用基于特異性基因檢測比對的分子生物學鑒定方法進行血清型鑒定。研究結果表明，遼寧省地區致病性豬鏈球菌主要以1、2、7型為主。

1 材料

2015年3月至2016年10期間，對遼寧省4個區域，每個區域選擇8～10個規模豬場進行調查，統計不同地區、不同生長階段、不同季節等的發病率、死亡率、發病類型。采集樣本共296份。健康SPFBALB/c小鼠，合格證號：SCXK(吉2003～0002) (錦州醫科大學實驗動物中心提供)。

2 方法

2.1 流行特征調查 從豬鏈球菌病發生的病型、變化趨勢、不同年齡、不同季節、不同地區混合感染情況進行統計。

2.2 鏈球菌病的臨床診斷方法和標準 參考農業部豬鏈球菌應急防治技術規范(農醫發[2005]20號)，通過臨診發病特點、典型癥狀和剖檢病變特征做出初步診斷[3]。

2.3 致病性試驗 小鼠感染試驗： 選取3株代表菌株分3組，對照組1組，共4組，每組20只小鼠，小鼠腹腔注射分離菌株BHI液體培養物0.2 mL (2×107CFU/mL) ，對照組腹腔注射相同劑量無菌BHI液體培養物。

動物回歸試驗： 30日齡斷奶健康仔豬8頭，分兩組，一組腹腔注射2 mL分離菌株(1、2、7、9型)( 2×107CFU/m L)BHI液體培養物。另一組腹腔注射2 mL無菌BHI液體培養物作對照[6]。

2.4 遼寧省豬鏈球菌的基因型鑒定 提取細菌DNA基因組，用特異性引物驗證，進行PCR 擴增，目的片段測序分析。

3 結果與分析

3.1 遼寧省豬鏈球菌病發生的病型和變化趨勢 從病型上來看，遼寧省豬鏈球菌發病的病理類型多樣并復雜化，表現為敗血型、腦膜炎型、膿腫型、關節炎型及肺炎混合型，其中，以腦膜炎型、混合型所占比例較高，平均為42.2%、30.65%。從變化趨勢看，敗血型逐漸減少，腦膜炎型增多，成為主要發病類型，其他類型變化不明顯。

3.2 遼寧豬鏈球菌病不同年齡和季節發病情況統計 從年齡和季節上來看，豬鏈球菌病在一年四季均有較高的發病率，雖然相同年齡不同季節豬的發病率差異不顯著(P>0.05)，但秋季和春季發病率有高于夏季和冬季的趨勢，哺乳仔豬冬季發病率最高，可能與溫差變化較大有關。分析結果顯示，秋季青年豬發病率顯著高于成年豬、哺乳仔豬(P<0.05)，春季青年豬發病率顯著高于成年豬(P<0.05)，冬季、夏季青年豬發病率與成年豬、哺乳仔豬無顯著差異(P>0.05)。

3.3 遼寧不同地區豬鏈球菌發病和混合感染情況統計 從區域不同的發病和混合感染來看，豬鏈球菌病在遼寧省各地均有發生，分布廣泛，其中營口、鞍山和大連發病率極顯著高于其他地區(P<0.01)，可能與上述地區養豬量較大，豬及豬產品運輸頻繁有關，丹東發病率較低，可能與上述地區養豬量較少，山區多形成天然疫情隔離屏障有關。豬鏈球菌病70%以上為混合感染，其中多病原混合感染率最高，其次混感較高的病原依次為副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

3.4 遼寧省豬鏈球菌的分離鑒定結果 經過革蘭染色觀察到鏡下的細菌形態、大小、排列方式非常典型。分離到的鏈球菌呈鏈狀或雙球排列的革蘭陽性球菌(見圖1)，初步判斷為鏈球菌。生化試驗結果均符合其生化特性。動物致病性試驗結果：注射小鼠后15 h全部死亡，病變組織染色革蘭陽性球菌，對照組未見異常。動物回歸試驗：試驗組動物全部死亡，通過細菌學觀察和特異性引物的PCR檢測，確定細菌為豬鏈球菌。

圖1 豬鏈球菌的革蘭染色結果

分離菌株經過16S rRNA PCR驗證，目的片段約1 450 bp左右，見圖2。經對比分離菌株序列的結果與生化鑒定的結果一致。

3.5 遼寧省豬鏈球菌的基因型鑒定 應用1、2、7、9型特異性基因對遼寧分離的豬鏈球菌流行菌株進行鑒定見圖3，結果表明,檢測2015年至2016年來遼寧的疑似豬血液、腦脊液、肝、脾、淋巴結樣品33份，檢出1型13份，2型14份,7型6份，陽性率分別為39.0%、42.0%和18.0%。主要有1、2、7型。

圖2 豬鏈球菌16S rRNA序列電泳結果

圖3 豬鏈球菌1型、2型、7型電泳結果

4 討論

結合調查明確了遼寧地區豬鏈球菌病發病日齡、季節、地區等特征，確證了該地區豬鏈球菌病的病型和變化趨勢，豬鏈球菌病表現為敗血型、腦膜炎型、膿腫型、關節炎型及肺炎混合型，敗血型逐漸減少，腦膜炎型和肺炎型增多，成為主要發病類型。該病在一年四季均有較高的發病率，但秋季和冬季發病率顯著高于夏季和冬季，保育豬春秋季節發病率較高。

應用細菌形態學、生物化學試驗、分子生物學方法，從遼寧地區鑒定了33株豬鏈球菌，通過動物致病性試驗可以100%致死小鼠和本動物仔豬。說明遼寧豬鏈球菌流行菌株具有很強的致病性。

應用特異性基因檢測分析方法確定了遼寧地區流行菌株主要血清型為1型、2型和7型。為遼寧地區建立有針對性的防治技術措施提供了基礎依據。

[1] Higgins R,Gottschalk M. Distribution of Streptococcus suis capsular types in 2000[J].2001,42(03):223-224.

[2] 吳德，羅會明,鄭慧貞.人-豬鏈球菌病流行病學研究進展[J].中華流行病學雜志,2007,28(4):402-404．

[3] 閔文龍.豬鏈球菌病的防治[J].醫學動物防制,2007,23(2):154-155.

S855.3

B

0529-6005(2017)08-0081-02

2017-03-29

遼寧省百千萬人才工程資助項目(2014921012)；遼寧省農業科技攻關重點項目(2011214001,LYHX2013035)

董筱萍(1984-),女，助教,碩士,從事教學與動物診療工作, E-mail:dongxiaoping2032@163.com

周鐵忠,E-mail:ztz1818@126.com