鯉IL-10錦鯉皰疹病毒核酸疫苗聯合免疫效果的研究

于 慧， 王 好， 祖岫杰, 康學會， 楊炳坤, 劉艷輝, 周井祥

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省水產科學研究院 ， 吉林 長春 130033)

鯉IL-10錦鯉皰疹病毒核酸疫苗聯合免疫效果的研究

于 慧1， 王 好1， 祖岫杰2, 康學會2， 楊炳坤2, 劉艷輝2, 周井祥1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省水產科學研究院 ， 吉林 長春 130033)

本研究選用鯉IL-10，構建pEGFP-N1-IL-10真核表達質粒，分別進行體外細胞轉染試驗和免疫魚的試驗，證明了重組質粒在細胞中能成功表達，體內免疫試驗ELISA結果顯示，抗體水平會隨著免疫次數、劑量的增加逐漸升高，三免后第1周的抗體水平最高，隨后抗體水平逐漸下降。相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，pEGFP-N1-IL-10與核酸疫苗pIRES-ORF81聯合免疫所產生抗體水平明顯升高，但差異不顯著(P>0.05)。

錦鯉皰疹病毒 ； 鯉白細胞介素10 ； 核酸疫苗pIRES-ORF81

錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)是能夠使鯉(Cyprinuscarpio)、錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)及其變種大量死亡的疾病，大面積暴發該病時，死亡率為80%～100%[1]。隨著全球水產品貿易迅猛發展，該病在世界范圍內肆意傳播，難以控制，對鯉魚養殖業構成嚴重威脅。目前國內外已經有一些預防錦鯉皰疹病毒病疫苗的相關報道，且具有一定效果。

1989年 Fiorentino 等[2]首次發現白細胞介素 10 (Interleukin-10，IL-10)。IL-10可以在很多細胞中產生， 如T 細胞亞群，單核細胞，巨噬細胞等。已獲得多種哺乳動物的 IL-10 序列，以及非哺乳動物，禽類、鰻魚、鱒魚、河豚魚等的IL-10 序列。目前認為 IL-10 具有多種免疫活性，它可以誘導外周耐受和免疫抑制，還在免疫調節中起關鍵作用。

本研究在核酸疫苗pIRES-ORF81作用的基礎上，將構建的pEGFP-N1-IL-10真核表達質粒與該核酸疫苗聯合，進行同時免疫，來探究鯉IL-10對于錦鯉皰疹病毒病發揮哪種免疫功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 150條250～300 g的健康鯉魚數尾(購自長春雙陽某漁場)，平均體長18 cm，試驗前在吉林農業大學動物科學技術學院養魚室充氧的20 ℃水中飼養2周，研究中使用自然光周期。

1.2 主要試劑 多聚肌苷酸胞苷酸(PolyI:C)，購自南京生利德生物技術有限公司； TRIZol?Reagent，購至Invitrogen；反轉錄試劑、T4 DNA連接酶等，購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自AxyGen公司；L-15液體培養基、新生牛血清/胎牛血清，購自HyClone公司。

1.3 細胞、病毒與質粒 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)由本實驗室分離保存[3];框鏡鯉尾鰭原代細胞由本實驗室繁殖保存；核酸疫苗PpIRES-ORF81質粒由本實驗室保存[4]。

1.4 引物的設計與合成 根據鯉IL-10 mRNA基因序列(GenBank上登錄的)，引物設計使用Primer Premiers 5.0軟件，上游引物P1序列：5′-AAGCTTATGGTTTTCAGTGGAGTCATCCTTT-3′；下游引物P2序列：5′-GAATTCAATCACGAACGGAGAGAAACTAC-3′。劃線部分依次為限制性酶切位點HindⅢ和EcoRⅠ，送上海生物工程技術服務有限公司合成引物。

1.5 IL-10基因的擴增、克隆及鑒定 試驗前18 h對試驗魚進行胞苷酸(500 mg/魚)注射，取新鮮鯉魚頭腎樣品及脾臟使用液氮對進行其充分研磨使之成粉末狀，利用TRIZol法提取RNA，并進行反轉錄反應，以上述反轉錄產物為模板，進行PCR反應，采用25 μL反應體系，反應條件如下: 94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，58.1 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環，72 ℃ 10 min，反應結束 4 ℃ 保存。將回收的IL-10目的基因與pMD-18T克隆載體16 ℃連接過夜，將連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，經篩選鑒定后，將陽性質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6 IL-10基因的真核表達載體的構建及鑒定 對測序正確的質粒和pEGFP-N1質粒分別用HindⅢ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定和回收， T4連接酶16 ℃連接過夜，將產物轉化至感受態細胞DH5α中，篩選克隆菌落接種至含卡那霉素的培養基中，提取質粒進行PCR和酶切鑒定雙重鑒定，選取陽性質粒命名為pEGFP-N1-IL-10。

1.7 重組質粒pEGFP-N1- IL-10在錦鯉鰭條細胞中的表達

1.7.1 重組質粒pEGFP-N1-IL-10的大量提取與純化 將含有pEGFP-N1-IL-10質粒的菌液擴搖至對數生長期，進行質粒大提，方法參照AxyGen質粒大量提取與純化說明書，使用分光光度計測定重組表達質粒在260 nm波長時的吸光值，根據重組表達質粒的濃度計算公式：質粒濃度(μg/μL)=OD260×稀釋倍數×50 μg/mL。

1.7.2 重組質粒pEGFP-N1- IL-10的轉染 用500 μL無血清培養基，分別稀釋3 μg重組質粒pEGFP-N1-IL-10和9 μg EndoFectionTMMax轉染試劑，充分混勻，室溫孵育5 min。在六孔板中，加入混勻的DNA-EndoFectionTM復合物，8字混勻后放入26 ℃培養箱孵育。轉染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染情況并采集圖片。分別提取細胞(轉染后)總RNA，方法與提組織RNA相似，再進行RT-PCR及PCR。

1.8 重組質粒pEGFP-N1- IL-10與核酸疫苗聯合免疫魚試驗 免疫試驗前，將魚分6組，每組10尾，組1 滅菌的PBS；組2 空白對照組；組3 pIRES-ORF81；組4～6組pIRES-ORF81+pEGFP-N1-IL-10(劑量分別為1 μg、5 μg、15 μg)；注射劑量為200 μL/尾，三次免疫間隔14 d。尾靜脈采血于免疫前、一免及二免后第一、二周，三免后一到三周。收集血清，間接ELISA檢測抗體水平

2 結果與分析

2.1 IL-10目的基因的擴增及鑒定 分別以提取的鯉魚頭腎RNA及脾臟RNA為模板，反轉錄為cDNA后，再分別以IL-10的P1，P2序列為引物，通過PCR擴增得到與預期大小一致的540 bp的目的片段，如圖1。用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ對pMD18-T-IL-10陽性質粒(PCR鑒定)分別進行雙酶切鑒定。結果顯示，在540 bp位置均有條帶，同時有一條2 000 bp以上條帶。與預期相符，說明成功構建pMD18-T-IL-10，如圖2。

圖1 IL-10 PCR擴增產物

M： DNA分子量標準； 1：PCR產物(IL-10)

圖2 雙酶切鑒定pMD18-T-IL-10

M：DNA分子質量標準； 1：雙酶切產物(pMD18-T-IL-10)

2.2 重組質粒pEGFP-N1-IL-10鑒定 分別用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ對PCR鑒定為陽性的重組質粒pEGFP-N1-IL-10進行雙酶切。結果顯示的目的片段大小與預期結果相符，在540 bp位置有條帶，同時有1條片段大小為4 645 bp的載體條帶。說明已經成功將IL-10基因克隆到pEGFP-N1真核表達載體上，如圖3。

圖3 酶切鑒定重組質粒pEGFP-N1-IL-10

M：DNA分子質量標準； 1：pEGFP-N1-IL-10酶切結果

2.3 重組表達質粒的轉染 將重組質粒pEGFP-N1-IL-10轉染至錦鯉鰭條細胞中，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到有質粒成功轉入細胞(如中插彩版圖4)。

2.4 RT-PCR檢測真核表達質粒的轉染情況 轉染成功后的細胞用TRIZol裂解，提取細胞總RNA，RT-PCR，以cDNA作為模板，用P1，P2作為引物進行PCR檢測。電泳后分別在位置540 bp處觀察到目的條帶，說明pEGFP-N1-IL-10已轉染成功，如圖5。

圖5 IL-10基因的PCR擴增結果

M：DNA 分子質量標準； 1：IL-10PCR產物

2.5 鯉魚血清中抗體水平ELISA檢測結果 注射前要進行一次采血，再向不同試驗組鯉魚分別注射對應的免疫劑，一免及二免后第1周和第2周，三免后第1～3周，尾靜脈采血。采用間接ELISA法檢測注射免疫劑后鯉魚血清中的抗體水平。通過平均數和標準差的計算，最終得出圖中數據。圖6為結果，依圖所見，除了PBS組和空白組，其他各組鯉魚血清中均能檢測出KHV特異性抗體，免疫次數增多抗體水平隨之增加。三免后1周，抗體水平達到峰值，之后趨于下降。增加質粒濃度抗體水平稍有增加，但不明顯。PBS組和空白組這兩組與注射重組質粒組的抗體水平差異顯著(P<0.05)。混合制劑pEGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81抗體水平有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；

圖6 不同劑量各組的血清抗體水平曲線

3 討論

IL-10是多效細胞因子，具有免疫刺激、免疫抑制雙重免疫調節活性。IL-10能夠促進B細胞及天然殺傷性細胞的分化和增殖，促進單核細胞和巨噬細胞及肥大細胞集落[5]。在免疫反應中，IL-10能夠平衡組織損傷及阻止病原入侵，在對抗病原體的過程中能夠減輕炎癥反應，保護組織免受過分的炎癥反應損傷。因此該細胞因子具有一定的特殊性，目前，在許多哺乳動物上已經有過對 IL-10 的研究，但是對于低等脊椎動物 ，IL-10 的研究還很少。特別是關于鯉IL-10的報道十分有限[6]。馮祥汝等[7]通過研究IL-10 在鯉魚不同組織部位中的表達情況證明了IL-10 參與鯉魚的早期免疫反應。

Segal B等[8],證明了在某些情況下，IL-10通過先天性免疫和適應性免疫，也能夠對惡性細胞的免疫反應產生積極作用。在接種抗癌疫苗之前給予 IL-10 能導致免疫抑制及腫瘤的形成，這與 IL-10 對 DC 的抑制作用一致。但是，在免疫接種之后注射 IL-10 能明顯增強其抗腫瘤免疫效果。

并且，同時注射疫苗和 IL-10的動物體內經受過抗原刺激的 CTL水平明顯高于只注射了疫苗的動物，表明IL-10 可以作為免疫佐劑維持 CTL 的水平。

本試驗通過體外轉染試驗證明了構建的真核質粒pEGFP-N1-IL-10可在鯉魚鰭條細胞中表達，采用pEGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81、聯合免疫制劑對試驗魚進行免疫，結果表明，抗體水平隨著免疫次數增多而有所增加，在三免后1周抗體水平趨于下降。3種劑量均獲得很好的免疫效果，且低劑量的核酸疫苗就可獲得較好的抗體水平。重組質粒濃度增加，抗體水平隨之增加，結果是具有顯著差異的，由此可見，針對錦鯉皰疹病毒病，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，聯合免疫制劑所產生的抗體水平更高，免疫效果更好，鯉IL-10可作為免疫佐劑以提高所接種疫苗的效果。

未來希望可以通過調控 IL-10 水平來調節免疫反應，但是由于該因子的特殊性，我們很難掌握免疫刺激和免疫抑制之間的平衡狀態，因此調節該細胞因子也具有較高的風險，我們必須掌握好最佳IL-10 的劑量以達到預期的免疫效果。

[1] Taylor N G H, Dixon P F, Jeffery K R,etal. Koi herpesvirus: distribution and prospects for control in England and Wales[J]. Journal of Fish Diseases, 2010, 33(3):221-230.

[2] Fiorentino D F, Bond M W, Mosmann T R. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones[J]. The Journal of experimental medicine, 1989, 170(6): 2081-2095.

[3] 朱霞, 李新偉, 王好,等. 一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J]. 中國預防獸醫學報, 2011, 33(5):340-343.

[4] 李新偉.錦鯉皰疹病毒ORF25、ORF81基因核酸疫苗的構建及免疫原性的研究[D].長春:吉林農業大學, 2012.

[5] Sabat R, Grutz G, Warszawska K,etal. Biology of interleukin-10[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2010, 21: 331-344.

[6] Wenjun, Ouyang, Sascha Rutz, Natasha K. Crellin,etal. Regulation and functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease[J]. Annual Review of Immunology, 2011, 29: 71-109.

[7] 馮祥汝，陳義龍，盧強.白細胞介素-10 的生物學功能及其在疾病中的作用研究進展[J].中國畜牧獸醫, 2012,39(3):74-77.

[8] Segal B,Glass D,Shevach E.Cutting edge:IL-10-producing CD4+-T cells mediate tumor rejection[J].Immunol,2002,168:1-4.

征訂啟事

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《中國獸醫雜志》編輯部

ImmuneeffectofcarpInterleukin-10andKoiHerpesvirusnucleicacidvaccinecombinedimmunization

YU Hui1, WANG Hao1, ZU Xiu-jie2, KANG Xue-hui2, YANG Bing-kun2, LIU Yan-hui2, ZHOU Jing-xiang1

(1.Institute of Animal Science and Technology of Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2.Jilin Academy of Fishery Sciences, Changchun 130033， China)

The eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-IL-10 were constructed based on IL-10 mRNA. In vitro cell transfection experiment , proved that the recombinant plasmid was successfully expressed in cells .ELISA results showed that antibody levels increased gradually with the increase of number and dose of immunization, The highest antibody level was on the first week after three immune. Then the antibody levels gradually declined. Compared with the single nucleic acid vaccine pIRES-ORF81, antibody levels in fish immunized with the combination of pEGFP-N1-IL-10 and nucleic acid vaccine pIRES-ORF81 increased , but it was not significant (P> 0.05).

Koi herpes virus ; Carp interleukin 10 ; Nucleic acid vaccine pIRES- ORF81

s:ZHOU Jing-xiang ； LIU Yan-hui

S942.5

A

0529-6005(2017)08-0083-04

2016-08-01

國家現代農業產業技術體系建設項目(CARS-46-29)；吉林省自然科學基金項目(20140101035JC)

于慧(1990-)，女，碩士生，從事動物病毒分子學研究，E-mail：1150520227@qq.com

周井祥，E-mail：zhjxnd@126.com；劉艷輝，E-mail：liuyanhui9@163.com