半滑舌鰨弧菌病病原的分離鑒定

徐曉麗 ， 葉紅梅 ， 侯純強(qiáng) ， 蔡 琰 ， 鐘文慧 ， 李賀密

(1.天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 , 天津 河西 300221 ; 2. 天津渤海水產(chǎn)研究所 , 天津 經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū) 300457)

半滑舌鰨弧菌病病原的分離鑒定

徐曉麗1， 葉紅梅1， 侯純強(qiáng)2， 蔡 琰1， 鐘文慧1， 李賀密1

(1.天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 , 天津 河西 300221 ; 2. 天津渤海水產(chǎn)研究所 , 天津 經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū) 300457)

從患病半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)內(nèi)臟中分離到2株優(yōu)勢菌株，人工感染試驗(yàn)證實(shí)菌株150803對(duì)半滑舌鰨具有致病性；采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析、16S rRNA等方法對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，菌株150803為革蘭陰性桿菌，生化特性與溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)較為接近，以hsp60基因?yàn)檫z傳標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將菌株150803與溶藻弧菌聚為一支，置信度為99%，采用特異性引物擴(kuò)增溶藻弧菌dnaJ基因得到預(yù)期144 bp的基因片段。綜合以上結(jié)果判定引起此次半滑舌鰨發(fā)病的病原為溶藻弧菌。對(duì)22種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)表明，菌株150803對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、菌必治敏感，對(duì)氟苯尼考、呋喃唑酮、苯唑青霉素等具有抗性。

半滑舌鰨 ; 溶藻弧菌 ;hsp60 ;dnaJ

半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGünther)隸屬于鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是近海一種大型暖溫性底棲魚類，性狀優(yōu)良，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)溫度鹽度范圍廣，生長速度快，且肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美，含有豐富的不飽和脂肪酸，深受廣大消費(fèi)者青睞，市場價(jià)格居高不下，是山東、河北、天津、遼寧等地區(qū)工廠化養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種。但在2011年半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)受體表潰瘍病及腹水病的影響，一度產(chǎn)量急劇下降，2015年才有所恢復(fù)，通過降低養(yǎng)殖密度、改善循環(huán)水系統(tǒng)，這兩種疾病得到了較好的控制，但新的病害又開始出現(xiàn)。2016年8月，河北曹妃甸養(yǎng)殖半滑舌鰨出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，死亡率達(dá)50%以上，均為30 cm左右的較大型個(gè)體，損失巨大。為查明該企業(yè)半滑舌鰨死亡原因，本研究取患病半滑舌鰨進(jìn)行病原分離，得到2株優(yōu)勢菌株，采用形態(tài)學(xué)、生化特性分析結(jié)合16S rRNA基因及hsp60基因?qū)λ蛛x的菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其致病性及藥物敏感性進(jìn)行分析，旨在探究半滑舌鰨的發(fā)病病原及其特性，為該病的診斷與防治提供科學(xué)參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 發(fā)病半滑舌鰨取自河北曹妃甸某工廠化養(yǎng)殖車間，體長30±3 cm；健康半滑舌鰨取自天津市興盛海淡水養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，全長(16±2) cm，體質(zhì)量(40±3) g，暫養(yǎng)于75 L塑料整理箱，水溫25 ℃，鹽度2%。2216E、TSB培養(yǎng)基、血平板、弧菌科細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離 取瀕死半滑舌鰨，刮取體表黏液、鰓及鰭潰爛處組織等制作水浸片鏡檢是否有寄生蟲及真菌。剖檢病魚，觀察內(nèi)臟器官病理變化，取接種環(huán)從病變處(肝臟、眼睛、腸道等部位)接種細(xì)菌，劃線接種于2216E平板/血平板；無菌操作取病魚膽汁涂布于血平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)菌株，以TSB凍存液(含15%甘油的TSB培養(yǎng)基)保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗(yàn) 本次從患病半滑舌鰨體內(nèi)分離到2株優(yōu)勢菌株，用于進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。所用半滑舌鰨飼養(yǎng)于45 L玻璃缸中，分3組，2組為試驗(yàn)組，分別注射分離所得的兩株菌株，一組為對(duì)照組，每組15尾魚。

感染試驗(yàn)采用腹腔注射的方式進(jìn)行，以含0.85% NaCl的生理鹽水調(diào)整感染試驗(yàn)用菌株菌懸液密度為3×107CFU/mL，試驗(yàn)組每尾魚注射0.2 mL菌液，對(duì)照組注射等量生理鹽水。注射后連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)魚，每天正常飼養(yǎng)、換1/3水、吸污，記錄半滑舌鰨的發(fā)病和死亡情況，并從人工感染發(fā)病的瀕死魚中，取患病癥狀與自然患病魚相似的再次分離、純化、鑒定細(xì)菌。

1.4 病原分離與生化鑒定結(jié)果 將純培養(yǎng)的細(xì)菌劃線接種于2216E平板、TCBS平板和血平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落特征，挑取單菌落，制作細(xì)菌滴片進(jìn)行革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。將細(xì)菌接種于生化鑒定管，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[1]以及《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[2]中所列細(xì)菌生化特性進(jìn)行比對(duì)鑒定。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 分別采用擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA、hsp60基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以及采用特異性引物擴(kuò)增溶藻弧菌dnaJ 基因的方法對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定。

16S rRNA和hsp60基因序列的PCR擴(kuò)增與測序 挑取純培養(yǎng)細(xì)菌的細(xì)菌懸液，煮沸后瞬時(shí)離心取上清作為PCR反應(yīng)的模板。16S rRNA和hsp60基因序列的擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[3-4]所述方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建： 將所分離菌株的16S rRNA和hsp60基因序列分別提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫，采用NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，選取與所得菌株同源性較高菌株的基因序列，采用Clustal x 1.81軟件比對(duì)，分別以16S rRNA和hsp60基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，采用Mega 5. 2基于鄰接法(Neighbor-joining，NJ法) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstraps檢測置信度，自舉數(shù)集1 000次。

分離菌株的PCR鑒定： 采用特異性引物擴(kuò)增溶藻弧菌dnaJ基因[5]，擴(kuò)增結(jié)束后取3～5 μL 進(jìn)行水平電泳，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.6 藥物敏感試驗(yàn) 采用藥敏紙片分析所分離菌株的藥物敏感性，調(diào)整菌懸液密度為1.5×108CFU/mL，以無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于MH平板，將藥敏紙片均勻貼在培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑(mm)，并按照藥敏紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病魚初檢 發(fā)病的半滑舌鰨不食，反應(yīng)遲鈍，游泳異常，躥高跳起，最后翹頭翹尾而死；體表黏液增多如覆一層白絮，尾鰭潰爛，眼睛充血、突出；剖檢發(fā)現(xiàn)病魚鰓發(fā)白，鰓絲腫脹，爛鰓嚴(yán)重，肝臟出血、充血，腹腔內(nèi)有血性腹水，膽汁發(fā)紅，性腺有點(diǎn)狀出血，腸道糜爛化膿，腸黏膜無彈性(圖1)。鏡檢未發(fā)現(xiàn)魚體表和體內(nèi)有寄生蟲。從患病魚肝臟、膽汁、眼睛處分離到形態(tài)相近的菌株150802，該菌株僅在血平板上生長，且生長緩慢需培養(yǎng)48 h以上，不溶血；從腸道中分離得到形態(tài)一致的菌落150803，生長迅速，在TCBS培養(yǎng)基上為黃色圓形菌落，有黏性(見中插彩版圖1、圖2)。挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，分別凍存于-80 ℃。

2.2 致病性驗(yàn)證 感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射菌株150803的試驗(yàn)組魚在感染第5天吃食明顯減少，第8天開始出現(xiàn)死亡，至25 d該試驗(yàn)組魚全部死亡。病魚體表黏液增多，肝充血、發(fā)紅，腸道有膿液，但無眼睛突出充血的癥狀，翹頭翹尾死亡現(xiàn)象。注射菌株150802的試驗(yàn)組及對(duì)照組魚無明顯異常，無一死亡。從人工感染后發(fā)病的瀕死魚腸道膿液中接菌劃線于TCBS平板，得到與感染用菌株150803形態(tài)一致的黃色菌落，經(jīng)鑒定所分離菌株的理化特性與原感染菌150803一致，表明150803為本次半滑舌鰨死亡的病原菌。

2.3 生化鑒定 將純培養(yǎng)的細(xì)菌劃線接種于2216E平板培養(yǎng)，菌株150803生長迅速，劃線后6 h即可長出肉眼可見的菌落，過夜培養(yǎng)后菌落直徑在2 mm以上，革蘭染色后菌體呈陰性短桿狀，長1～3 μm，無莢膜；生化鑒定結(jié)果顯示菌株150803具運(yùn)動(dòng)性，氧化酶和接觸酶均呈陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，對(duì)弧菌抑制劑O/129(150 μg)敏感，進(jìn)一步的生化鑒定結(jié)果顯示，菌株150803 V-P反應(yīng)陽性，還原硝酸鹽，β-半乳糖苷酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶均為陰性，淀粉酶、明膠酶、鳥氨酸脫羧酶均為陽性，能夠利用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，不能利用肌醇、甘露糖、阿拉伯糖、水楊苷、乳糖等(表1)。將生化檢測結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》弧菌屬細(xì)菌及目前已分離到的溶藻弧菌菌株[6-10]的表型特征進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，菌株150803與溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)最為接近。

表1 菌株150803和溶藻弧菌的生理生化特征的比較

+:陽性；-:陰性；V:可變

2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用通用引物擴(kuò)增所分離菌株的16S rRNA基因，得到1 500 bp的核酸片段。Blast分析結(jié)果顯示，菌株150802與美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)16S rRNA 基因序列高度一致，相似度為99%；菌株150803與多株溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌等弧菌屬細(xì)菌的16S rRNA 基因序列高度一致，相似度為98%以上，以16S rRNA基因?yàn)檫z傳標(biāo)記無法將菌株150803準(zhǔn)確鑒定到種。擴(kuò)增菌株150803的hsp60基因，Blast分析結(jié)果顯示，菌株150803與多株溶藻弧菌的相似度最高，以hsp60基因?yàn)檫z傳標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將150803與溶藻弧菌聚為一支(圖3)，置信度為99%。且采用特異性引物擴(kuò)增溶藻弧菌保守基因dnaJ，得到預(yù)期144 bp的基因片段(圖4)。綜合菌株150803 的形態(tài)、生化特征和16S rRNA、hsp60基因序列分析及dnaJ基因擴(kuò)增結(jié)果，判定菌株150803為溶藻弧菌。

2.5 藥物敏感性 在所試的22種抗生素中，菌株150803對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素(120 μg/disc)、菌必治敏感；對(duì)強(qiáng)力霉素中度敏感；對(duì)氟苯尼考、呋喃唑酮、苯唑青霉素等具有抗性，結(jié)果見表2。

3 討論

圖3 以hsp 60基因構(gòu)建的Vibrio 系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 菌株150803對(duì)抗菌藥物的敏感性

S:敏感 Sensitive； R:抗性 Resistant； I:中度敏感Intermediate

圖4 菌株150803 dna J基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

溶藻弧菌是一種常見的海洋條件致病菌，廣泛存在于世界各地的海水中及江河入海口的水域之中，數(shù)量居海水類弧菌之首，與副溶血弧菌和哈維氏弧菌并稱海水三大優(yōu)勢弧菌[6]。溶藻弧菌可對(duì)多種水生動(dòng)物致病，迄今已陸續(xù)從養(yǎng)殖刺參(Apostichopusjaponicus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、石斑魚、皇姑魚(Nibeaalbiflora)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、魁蚶(Scapharcabroughtonii)、對(duì)蝦、牡蠣、南日鮑(Haliotisdiscusnanf)體內(nèi)分離到該菌并通過回感試驗(yàn)證實(shí)溶藻弧菌對(duì)以上宿主的致病性[6-10]。該研究從發(fā)病死亡的半滑舌鰨腸道膿液中分離得到大量形態(tài)均一的菌落，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)及分子生物學(xué)鑒定所得的優(yōu)勢菌株為溶藻弧菌，并通過回感試驗(yàn)證實(shí)該菌對(duì)半滑舌鰨的致病性，是溶藻弧菌對(duì)半滑舌鰨致病的首次報(bào)道。在該研究中，菌株150803的感染試驗(yàn)歷時(shí)相對(duì)較長，可能因病原在腸道中的定植、大量繁殖、致魚死亡需要相對(duì)長的時(shí)間；病死魚并未出現(xiàn)眼球充血、突出、翹頭翹尾的癥狀，據(jù)分析此癥狀可能與肝臟、眼睛處分離得到的另外一株菌150802有關(guān)，菌株150802的16S rRNA基因序列與美人魚發(fā)光桿菌最為接近，也為已報(bào)道的半滑舌鰨的病原菌，可引起半滑舌鰨體表潰爛、鰭基部出血、內(nèi)臟結(jié)節(jié)等[11]，該研究所得到的菌株150802生長速度較慢，單獨(dú)進(jìn)行回感試驗(yàn)時(shí)未引起半滑舌鰨發(fā)病死亡，未對(duì)其進(jìn)行深入研究。

在細(xì)菌分類研究中，16S rRNA基因序列是最常用的遺傳標(biāo)記，但在該研究中菌株150803與副溶血弧菌、哈維氏弧菌、輪蟲弧菌等的16S rRNA 基因序列相似度均在98%以上，無法將菌株鑒定到種。熱休克蛋白hsp基因也是一種常用于生物進(jìn)化及分類的遺傳標(biāo)記，Kwok等的研究表明，hsp60基因適合用于研究海洋弧菌系統(tǒng)分類[12]。該研究擴(kuò)增了菌株150803的hsp60基因并構(gòu)建了以hsp60為遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示150803與溶藻弧菌聚為一支，具有較高的置信度。另外在弧菌屬中，danJ基因是一種編碼熱休克蛋白40的管家基因，與reca、rpoa等持家基因比較，序列保守性更低，可作為弧菌鑒別的新工具。該研究采用Nhung等[4]建立的基于dnaJ基因的致病性弧菌檢測方法，得到預(yù)期144 bp的堿基片段，進(jìn)一步證實(shí)菌株150803為溶藻弧菌。

對(duì)于魚類細(xì)菌病的治療，生產(chǎn)上常用的方法是使用抗生素。該研究采用藥敏紙片法分析了所分離菌株對(duì)22種抗生素的敏感性，在所試的22種抗生素中，菌株150803對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素(120 μg/disc)、菌必治敏感；僅恩諾沙星在國標(biāo)漁藥之列，對(duì)氟苯尼考、呋喃唑酮、氯霉素、苯唑青霉素等具有抗性，提示細(xì)菌抗性也在逐漸增強(qiáng)。鑒于溶藻弧菌主要感染半滑舌鰨腸道，病程相對(duì)較長，且魚類腸道本身也具有一定的免疫功能，因此生產(chǎn)上對(duì)于這一病原應(yīng)以預(yù)防為主，半滑舌鰨為工廠化養(yǎng)殖，降低養(yǎng)殖密度，定期維護(hù)循環(huán)水設(shè)備，定期監(jiān)測水質(zhì)及水體中弧菌總數(shù)變化，保證充足溶氧，同時(shí)可在飼料中添加一定量的免疫增強(qiáng)劑提高魚體抗病力，減少魚體應(yīng)激，這些措施均能夠降低疾病的發(fā)生機(jī)率。

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IsolationandidentificationofpathogenresponsibleforthevibriosisinculturedCynoglossussemilaevisis

XU Xiao-li1, YE Hong-mei1, HOU Chun-qiang2, CAI Yan1, ZHONG Wen-hui1, LI He-mi1

(1. Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221，China; 2. Tianjin Bohai Sea Fisheries Research Institute, Tianjin 300457,China)

Dominant bacteria designed as 150802 and 150803 were isolated from the internal of diseasedCynoglossussemilaevisisand the stain 150803 was proved to be highly pathogenic toC.semilaevisisby artificial challenge. The biological characteristics including morphological, physiological and bio-chemical characteristics were examined, and the hsp60 gene was sequenced and compared with the sequences deposited in GenBank databases. The results showed that the strain 150803 was Gram-negative bacilli. Based on the physiological and biochemical characteristic analysis, strain 150803 was identified asVibrioalginolyticus. Phylogenetic trees of Vibrio based on hsp60 gene indicated that strain 150803 showed the highest level of similarity toV.alginolyticusand the bootstrap was 99%. The expected 144 bp-nucleic acid fragment ofV.alginolyticusdnaJgene was amplified with the stain 150803 as a template. These results demonstrated that the vibriosis pathogen causing mortality inC.semilaevisiswasV.alginolyticus. Antimicrobial susceptibility assay showed that strain 150803 was susceptible to enrofloxacin, ciprofloxacin, gentamicinum and rocephin, but resistant to florfenicol, furazolidone, oxacillin, etc.

Cynoglossussemilaevis;Vibrioalginolyticus; hsp60 ;dnaJ

LI He-mi

S941.41+7

A

0529-6005(2017)08-0086-05

2017-03-28

天津市科委重大科技工程計(jì)劃項(xiàng)目(14ZCDGNC00100);天津市水產(chǎn)局科研推廣項(xiàng)目(J2016-03)

徐曉麗(1983-)，女，博士，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫工作，E-mail：1234xxl1234@163.com

李賀密，E-mail：scjstgz688@163.com