間充質干細胞治療馬運動系統疾病研究進展

馮 杰 ， 梁 璐 ， 王 斌 ， 韓忠朝

(1.天津百恩生物科技有限公司 ， 天津 空港經濟區 300308 ； 2.國家干細胞工程技術研究中心 ， 天津 濱海 300457)

間充質干細胞治療馬運動系統疾病研究進展

馮 杰1， 梁 璐1， 王 斌1， 韓忠朝2

(1.天津百恩生物科技有限公司 ， 天津 空港經濟區 300308 ； 2.國家干細胞工程技術研究中心 ， 天津 濱海 300457)

近幾十年來，醫學重心正在從修復轉移到再生。包括干細胞在內的再生醫學已成為醫學界最為關注的研究領域之一，在獸醫領域，干細胞基礎研究和臨床研究也有迅猛的發展。其中關于干細胞治療狗和馬的運動系統疾病的研究報道最多。賽馬的肌肉骨骼系統特別容易受傷，是其結束運動職業生涯的主要原因。其中關節和肌腱損傷的預后較差，這是再生醫學研究的熱點。本文綜述了近年來間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)治療馬的關節和肌腱損傷疾病的治療方法和存在問題，期望為干細胞治療此類疾病提供借鑒。

1 MSC治療馬關節炎

退行性關節病(degenerative joint disease，DJD)，又稱骨關節炎，主要特點是關節周圍組織退化性病變，是馬最主要的慢性疾病，嚴重影響馬的運動能力。DJD的傳統治療是在延長休息或限制運動的情況下，應用抗炎藥和鎮痛藥，此外還有一些疾病修飾治療藥物，如氨基葡萄糖、硫酸軟骨素和透明質酸等。傳統治療只能減輕疼痛，并不能修復退化損傷的關節。關節置換術可以治療該疾病，但造價高，推廣不普遍。干細胞因其損傷修復能力和簡單的治療方法，受到了越來越多的關注。

多篇研究報道表明，對健康馬進行單次關節腔注射同種異體MSC或自體MSC是安全的，不會引起全身反應，只有滑膜液會有短暫的炎癥反應[1-3]。多個供者混合的異體MSC多次關節內注射是安全的，反復注射不會引起超敏反應，只有短暫的滑膜炎癥，癥狀會逐漸緩解恢復正常[4]。另外對炎癥的關節注射同種異體MSC有輕微的自限性的炎癥[5]。但也有報道骨髓間充質干細胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells，BMMSC)治療可以減少滑膜積液產生，降低PGE2濃度，治療后觀察70 d沒有觀察到副作用[6]。總體而言異體細胞治療是安全的。

已有的動物實驗和臨床研究證實，MSC治療馬關節炎是有效的。間充質干細胞治療馬關節炎的詳細研究方案和治療結果見表1。Spaas等[7]報告了一個慢性DJD導致的嚴重的單側前肢跛行馬的病例，該馬患病1年，期間經過傳統治療(限制運動，口服非甾體抗炎藥，關節內注射甾體抗炎藥和透明質酸)無效，經過兩次自體外周血MSC關節內注射治療后，該病馬一年內沒有復發跛行，并且恢復參加比賽。Ferris等[8]對33例膝關節損傷的馬進行了骨髓MSC的關節內注射。細胞治療后恢復工作的百分比(75%)比單純手術恢復的 (60%～63%)要高，且具有統計學差異。臨床研究證明，細胞治療關節損傷是安全有效的，與傳統方法比較能夠提高治療后的恢復能力。

軟骨退化病變是關節炎的主要病理變化。MSC可以治療軟骨缺損，能增加蛋白多糖含量和提高組織硬度，從而提高軟骨修復的質量[9]。通過關節腔注射自體骨髓MSC治療關節炎后，觀察到細胞定植在軟骨組織的表面和內部，并且注射后6個月仍能檢測到GFP標記的MSC[10]。定向誘導分化為軟骨細胞的MSC可以更好的治療關節炎。Broeckx等[11]在輕至中度馬DJD病例中進行了不同細胞的比較試驗，試驗結果表明，異體外周血MSC和富血小板血漿(Platelet rich plasma，PRP)治療可以改善關節炎，且聯合治療效果更好，治療效果可以持續1年。

2 MSC治療馬肌腱炎

肌腱病在人類和馬中都是常見疾病，其中發病率最高的是淺屈肌腱炎(Superficial Digital Flexor Tendon，SDFT)。肌腱受傷后，愈合過程緩慢，而且肌腱的愈合是通過纖維化瘢痕形成而不是再生，導致愈合的肌腱機械強度低，運動性能差，并且發生再損傷的幾率很高[12]。而MSC治療是通過促進肌腱再生來促進肌腱修復。

表1 間充質干細胞治療馬關節炎的研究

LRS：lactated ringer′s solution,乳酸林格氏液液 ； HA：sodium hyaluronate，透明質酸鈉

目前臨床上自體MSC[13-17]和異體MSC[18-19]治療肌腱炎均有報道，已有的研究統計見表2。細胞來源主要是骨髓MSC[13，15-16，20-21]和脂肪MSC[14，18，22]，此外還有外周血MSC[17]和臍帶血MSC[19]。MSC治療肌腱損傷是通過改善肌腱結構來實現肌腱修復的。MSC治療后肌腱軟骨低聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)的表達升高，肌腱結構改善[14]。

賽馬的SDFT治療是具有挑戰性的，無復發的重返賽場是對肌腱功能恢復的一個重大考驗。Smith[15]總結了自體骨髓MSC治療中度至重度急性SDFT損傷的病例，共168匹賽馬進行了自體MSC治療，返回賽場后再損傷的概率僅18%，而傳統治療后有56%的賽馬發生了再次損傷。研究人員對不完全損傷的肌腱進行自體骨髓MSC注射，實驗組的11匹賽馬中，9匹恢復賽馬能力，并且在兩年內沒有復發，超聲掃描顯示，肌腱纖維形成了正確的導向，而且無異位骨沉積發生。而對照組的所有15匹賽馬在平均7個月的時間內均發生了復發，超聲掃描顯示肌腱有纖維化形成[13]。

干細胞對于傳統方法治療無效的SDFT具有很好的治療效果。對3例傳統方法治療無效的SDFT賽馬(10～20歲)進行自體外周血干細胞治療，4～5個月之后進行超聲波檢查發現損傷的肌腱已完全恢復，3年之內沒有發生再損傷。而接受傳統治療的3匹賽馬，肌腱處出現纖維化，在恢復后3～6個月內都出現了再損傷[17]。

異體脂肪MSC可以與自體PRP聯合應用治療肌腱損傷。研究者使用葡萄糖酸鈣形成血小板凝膠作為3D生物支架，將MSC和PRP均勻的分布在3D支架網絡內，將其完全填充在損傷部位，通過此方法治療，87.5%(14/16)的馬匹恢復正常[18]。

3 干細胞臨床研究與應用的現狀

在臨床研究和應用方面歐美起步較早，最早從2004年便開始了細胞治療在馬獸醫中的臨床研究。美國的VetStem Biopharma公司早在2004年就開始應用脂肪MSC治療馬的肌腱損傷，到2010年累計治療的馬匹達到4 000匹。美國的Equine Partners America LLC公司，從2010年起利用BM-MSCs或者含血小板和少量干細胞的骨髓濃縮物(Bone Marrow Aspirate Concentrate，BMAC)治療馬的肌腱、韌帶和軟組織損傷[23]。牙周韌帶干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs) 比牙齦組織來源的MSC(gingival mesenchymal stem cells，GMSC)和BMMSC有更好的成肌腱能力，將細胞裝載在結合了TGF-β3的RGD三肽的海藻酸鈉微球里，能明顯的促進肌腱再生，是干細胞與組織工程材料結合的典型案例[24]。已報道用于馬的運動系統疾病臨床治療研究的MSC主要來源于骨髓和脂肪。脂肪來源的MSC通常采自尾根部的脂肪組織，獲得容易，創傷小，體外處理時間短(48 h)，商業化比較成熟，臨床應用廣泛[25]。骨髓來源的MSC主要采自胸骨和髂骨，創傷大，體外處理時間長(2～3周)[26-27]。如何開發更好的MSC來源，以及如何更有效的輸送MSC進入損傷部位發揮作用，是未來的一個發展方向。

表2 MSC治療馬肌腱炎研究統計

BMMNC:Bone Marrow Mononucleated Cells，骨髓單個核細胞 ； SL:懸韌帶韌帶炎 ； DDFT:深屈肌腱鞘炎 ； ICL:下韌帶韌帶炎 ； BA:生物化學分析 ； CE:臨床檢查 ； H:組織病理學檢查 ； IHC:免疫組織化學檢查 ； MT:機械測試 ； N/A: not applicable ； NI:not included,無 ； PCR:聚合酶鏈反應 ； S:閃爍掃描法 ； U:超聲波檢查

4 存在問題及展望

人們對MSC促進肌腱修復的機制了解較少。自然愈合是形成瘢痕組織，而MSC治療是通過促進基質再生，通過誘導基質重塑成正常肌腱來進行肌腱修復的[28]。但具體MSC如何有效的修復肌腱仍需要更加深入的研究。

研究者普遍認為，MSC治療不會出現非預期分化，但也有少數報道發現異位骨的形成。Awad[29]等研究發現用于兔子肌腱修復的MSC-膠原蛋白移植物，28%會在再生部位形成異位骨組織。作者認為，導致異位骨形成的原因，一方面是兔子MSC的純度不夠。兔子MSC中可能混合了成骨祖細胞，在周圍骨環境的成骨誘導因子作用下，就形成了異位骨組織。另一方面，MSC細胞介導的膠原凝膠收縮，可能促進了骨形成。由此可見，干細胞的質量控制對治療的效果和安全性至關重要，需要有嚴格的質量標準和科學的治療方案。確立科學的治療方案和最佳的治療方式需要更多的臨床研究和病例積累。

近年來，中國現代化馬場越來越多，人們對馬和賽馬的關注日益增加，全國各地的馬術賽馬運動蓬勃發展，馬匹的馴養與醫療越來越受到重視。細胞治療為馬的運動系統疾病帶來了新的治療策略，能夠更加有效的治療馬匹的運動損傷，延長馬匹的競賽年限，提高其競技能力。

[1] Carrade D D，Owens S D，Galuppo L D，etal. Clinicopathologic findings following intra-articular injection of autologous and allogeneic placentally derived equine mesenchymal stem cells in horses[J]. Cytotherapy，2011，13(4)：419-430.

[2] Boone L. Intra-articular administration of allogeneic equine bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. Athens，Georgia：University of Georgia，2013.

[3] Pigott J H，Ishihara A，Wellman M L，etal. Inflammatory effects of autologous，genetically modified autologous，allogeneic，and xenogeneic mesenchymal stem cells after intra-articular injection in horses[J].Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology，2013，26(6)：453-460.

[4] Ardanaz N，Vázquez F J，Romero A，etal. Inflammatory response to the administration of mesenchymal stem cells in an equine experimental model：effect of autologous, and single and repeat doses of pooled allogeneic cells in healthy joints[J]. BMC Veterinary Research，2016，12：65.

[5] Williams L B，Koenig J B，Black B，etal. Equine allogeneic umbilical cord blood derived mesenchymal stromal cells reduce synovial fluid nucleated cell count and induce mild self-limiting inflammation when evaluated in an LPS induced synovitis model[J]. Equine Vet J，2015，47(5)：503-632.

[6] Frisbie D D，Kisiday J D，Kawcak C E，etal. Evaluation of adipose-derived stromal vascular fraction or bone marrow-derived mesenchymal stem cells for treatment of osteoarthritis[J]. Journal of Orthopaedic Research，2009，27，1 675-1 680.

[7] Spaas J H，Oosterlinck M，Broeckx S，etal. Treatment of equine degenerative joint disease with autologous peripheral blood-derived mesenchymal stem cells: a case report[J]. Vlaams Dierg Tijdschrift，2012，81：11-15.

[8] Ferris D J，Frisbie D D，Kisiday J D，etal. Clinical outcome after intra-articular administration of bone marrow derived mesenchymal stem cells in 33 horses with stifle injury[J]，2014，43(3)：255-265.

[9] McIlwraith C W，Frisbie D D， Rodkey W G，etal. Evaluation of intra-articular mesenchymal stem cells to augment healing of microfractured chondral defects[J]. Arthroscopy，2011，27:1 552-1 561.

[10] Mokbel A N，Tookhy O E，Shamaa A A，etal.Homing and reparative effect of intra-articular injection of autologus mesenchymal stem cells in osteoarthritic animal model[J]. BMC Musculoskeletal Disorders，2011，12：259.

[11] Broeckx S，Zimmerman M，Crocetti S，etal. Regenerative therapies for equine degenerative joint disease：a preliminary study[J].PLoS One，2014，9(1)：e85917.

[12] Sharma P，Maffulli N.Biology of tendon injury：healing，modeling and remodeling[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact,2006，6(2)：181-190.

[13] Pacini S，Spinabella S，Trombi L，etal.Suspension of bone marrowderived undifferentiated mesenchymal stromal cells for repair of superficial digital flexor tendon in race horses[J]. Tissue Eng，2007，13：2 949-2 955.

[14] Nixon A J，Dahlgren L A，Haupt J L，etal.Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis[J]. Am J Vet Res，2008，69：928-937.

[15] Smith R K W.Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy[J]. Disabil Rehabil，2008，30：1 752-1 758.

[16] Godwin E E，Young N J，Dudhia J，etal. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon[J]. Equine Vet J，2012，44：25-32.

[17] Marfe G，Rotta G，De Martino L，etal.A new clinical approach：use of blood-derived stem cells (BDSCs) for superficial digital flexor tendon injuries in horses[J]. Life Sci，2012b，90：825-830.

[18] Del B M，Ricco S，Ramoni R，etal. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates：their association in vitro and in vivo[J]. Vet Res Commun，2008，32：S51-S55.

[19] Van Loon V J F，Scheffer C J W，Genn Herman J，etal. Clinical follow-up of horses treated with allogeneic equine mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood for different tendon and ligament disorders[J]. Veterinary Quarterly，2014，34：92-97.

[20] Schnabel L V，Lynch M E，Meulen M C，etal. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons[J]. J Orthopaed Res，2009，27：1 392-1 398.

[21] Crovace A，Lacitignola L，Rossi G，etal. Histological and immunohistochemical evaluation of autologous cultured bone marrow mesenchymal stem cells and bone marrow mononucleated cells in collagenase-induced tendinitis of equine superficial digital flexor tendon[J]. Vet Med Int，2010： Article I D 250978.doi:10.4061/2010/250978.

[22] Carvalho A d M，Alves A L G，Oliveira P G G d，etal.Use of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for experimental tendinitis therapy in equines[J]. J Equine Vet Sci，2011，31：26-34.

[23] Fortier L A，Potter H G，Rickey E J，etal. Concentrated bone marrow aspirate improves full-thickness cartilage repair compared with microfracture in the equine model[J].J Bone Joint Surg Am，2010，18，92(10)：1 927-1 937.

[24] Moshaverinia A，Xu X，Chen C，etal. Application of stem cells derived from the periodontal ligament or gingival tissue sources for tendon tissue regeneration[J]. Biomaterials，2014，35(9)：2 642-2 650.

[25] Gutierrez-Nibeyro S D. Commercial cell-based therapies for musculoskeletal injuries in horses[J]. Veterinary Clinics of North America：Equine Practice，2011，27：363-371.

[26] Iacono E，Brunori L，Pirrone A，etal. Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid, umbilical cord blood and Wharton's jelly in the horse[J]. Reproduction，2012，143(4)：455-468.

[27] Adams M K，Goodrich L R，Rao S，etal.Equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMDMSCs) from the ilium and sternum: are there differences? Equine Vet [J]，2013，45(3)：372-375.

[28] Smith R K 1, Werling N J, Dakin S G,etal. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy[J]. PLoS One, 2013 Sep 25;8(9):e75697.

[29] Awad H A，Boivin G P，Dressler M R，etal.Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite[J]. J Orthop Res，2003，21：420-431.

S859.79+7

A

0529-6005(2017)08-0053-04

2017-04-18

馮杰(1982-)，女，碩士，主要從事間充質干細胞研究，E-mail:fengjie2891@126.com

韓忠朝 E-mail:hanzhongchao@hotmail.com