五味子甲素對MPP+致SH-SY5Y細胞ERK信號轉導通路的影響

李 妍 ， 張 巍 ， 蔡同建 ， 趙東海 ， 羅 軍 ， 呂士杰

(1.吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 吉林 132013；2.中國人民解放軍第三軍醫大學軍事預防醫學院 ， 重慶 沙坪壩 400038)

五味子甲素對MPP+致SH-SY5Y細胞ERK信號轉導通路的影響

李 妍1， 張 巍1， 蔡同建2， 趙東海1， 羅 軍1， 呂士杰1

(1.吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 吉林 132013；2.中國人民解放軍第三軍醫大學軍事預防醫學院 ， 重慶 沙坪壩 400038)

通過體外培養SH-SY5Y細胞，Tunel法觀察五味子甲素(Schisandra A，SchA)對MPP+染毒SH-SY5Y細胞形態的影響；激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞核的變化；Western-Blot檢測各組SH-SY5Y細胞中ERK及p-ERK蛋白表達水平的不同，探討SchA對1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+)引起的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡及ERK信號轉導通路的影響。結果發現，與正常對照組相比，1mmol/L MPP+染毒可引起SH-SY5Y細胞形態明顯改變，凋亡細胞明顯增多；各濃度組 SchA干預均可有效抑制SH-SY5Y細胞的凋亡。與對照組比較，MPP+組細胞中p-ERK蛋白表達明顯抑制；而與MPP+染毒組相比，SchA干預組p-ERK蛋白表達明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴效應。結果表明，MPP+具有促進SH-SY5Y細胞凋亡的作用，而SchA能明顯緩解MPP+引起的SH-SY5Y細胞凋亡，該作用可能與ERK信號轉導通路活性改變有關。

MPP+； 五味子甲素 ； 帕金森病細胞模型 ； 凋亡 ； ERK

五味子甲素(Schisandra A,SchA)是從我國傳統中藥五味子中提取的一種木脂素類生物活性物質，是五味子的主要藥理活性成分之一[1]。近年來的研究結果顯示，五味子木脂素具有廣泛的中樞神經系統調節功能[2-3]。劉絮等的實驗結果顯示，五味子木脂素可通過γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid，GABA-R) 而發揮顯著的抗焦慮作用[4]。夏楠等研究發現，五味子能夠增強機體的抗氧化作用，有效降低機體的應激反應[5]。謝云亮等進一步通過實驗證實，五味子木脂素能夠抑制腦組織的脂質過氧化損傷，從而恢復中樞神經細胞的正常功能[6]。此外，有研究結果顯示，五味子木脂素中的五味子乙素對帕金森病模型細胞及動物模型均具有明顯的保護作用，可提高細胞的增殖能力，并降低細胞的凋亡水平[7]。

我們之前的研究發現，五味子木脂素的主要成分SchA能夠促進帕金森病模型細胞的增殖，減輕細胞損傷[8]。本研究在前期實驗的基礎上，進一步研究SchA對帕金森病模型細胞凋亡水平的影響，并初步探討其相應分子機制，為SchA藥理活性研究的完善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院； MPP+為美國Sigma公司產品；SchA，中國藥品生物制品檢定所生產；Tunel試劑盒，購自美國Roche公司；AO/EB染料，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；細胞培養箱，北京東方安若生化科技有限公司生產；倒置顯微鏡為日本奧林巴斯有限公司生產。

1.2 細胞培養 SH-SY5Y細胞在含10%體積分數胎牛血清，并含雙抗的DMEM高糖培養基中貼壁生長，將細胞培養瓶置于37 ℃、含5% CO2的條件下常規培養。

1.3 配制不同濃度的SchA 根據前期實驗結果，溶劑 DMSO的工作液體積濃度選擇為0.3%，SchA在DMEM培養基中的終濃度分別為1、3、5 μmol/L[7]。

1.4 MPP+濃度的選擇 我們通過前期實驗發現，不同濃度的MPP+處理SH-SY5Y細胞48 h，其藥物的IC50值為0. 986 mmol /L，接近1 mmol /L，因此在后續試驗過程中SH-SY5Y細胞培養基中MPP+的工作液濃度確定為1 mmol /L[7]。

1.5 AO/EB染色觀察SH-SY5Y細胞形態學改變 各組細胞培養于24孔無菌培養板中，細胞分為對照組、MPP+組(1 mmol /L MPP+)、MPP+及不同濃度的SchA共同作用組(1 mmol/L MPP++1 μmol/LSchA，1 mmol/L MPP++3 μmol/LSchA，1mmol/L MPP++5 μmol/LSchA)，加入AO/EB染料后激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞核形態改變。

1.6 Tunel染色檢測細胞凋亡水平 SH-SY5Y細胞常規接種于24孔板內，各組細胞給藥48 h后，4%多聚甲醛固定，按Tunel試劑盒操作步驟進行處理，光學顯微鏡下觀察及拍照。

1.7 Western-Blot檢測ERK及p-ERK表達水平 常規收集細胞，BCA法測定各組蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，低溫電轉至PVDF膜上。ERK、p-ERK一抗用封閉液稀釋后加于PVDF膜上，4 ℃孵育過夜。之后加入HRP標記的二抗37 ℃反應1 h，在膜上滴加化學熒光液，曝光顯影。

2 結果

2.1 AO/EB雙染觀察各組細胞形態學變化 各組SH-SY5Y細胞經AO/EB雙染后結果顯示，對照組絕大多數細胞細胞核呈圓形或橢圓形的綠色熒光，MPP+染毒組細胞核形狀差異較大，橙紅色細胞核斑塊、碎片較多，而給予了 1～5 μmol/L schA后橙紅色細胞核比例明顯減少(見中插彩版圖1)。

2.2 Tunel染色檢測各組細胞凋亡水平 MPP+處理48 h后，與對照組相比，可見較多的濃染細胞核及細胞核碎片，而隨著SchA濃度的增加，凋亡SH-SY5Y細胞數逐漸減少(見中插彩版圖2)。

2.3 SchA對MPP+染毒的SH-SY5Y細胞ERK及p-ERK表達量的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，MPP+染毒組SH-SY5Y細胞p-ERK相對表達量明顯降低(P<0.05)，提示MPP+可抑制ERK信號轉導通路的活化，而與MPP+染毒組相比，SchA干預能夠有效促進ERK的磷酸化活化(P<0.05，圖3)。

3 討論

隨著人類社會逐漸進入老齡化，帕金森病(Parkinson′s disease, PD)的發病率不斷增多。PD患者一般于50歲以后發病，60歲以后進入發病高峰期。目前臨床上尚未找到有效控制疾病發展的方法及手段，而尋找及研發有效治療藥物一直是PD防治的重點內容。在PD的發病過程中，多巴胺能神經細胞丟失是PD的重要發病機制和引起PD各種臨床癥狀的重要原因[9]。我們的實驗結果顯示，與對照組相比，PD模型組細胞存在明顯的細胞凋亡現象，提示凋亡可能是PD神經細胞損失的重要原因。

細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)發現于20世紀80年代，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。大量的研究結果證實，作為絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路家族成員之一，ERK信號轉導通路與體內多種生理活動有關。當ERK發生磷酸化活化后，能夠促進細胞的生長、增殖及分化，并能夠顯著抑制細胞凋亡[10-11]，ERK1及ERK2是ERK 家族中最重要的成員，廣泛表達于全身各種組織細胞中。有研究發現，ERK信號轉導通路活化后，能促進小鼠海馬長時程增強(1ong-term potentiation，LTP)的形成[12]。另有研究顯示，ERK信號轉導通路的活化與學習記憶過程密切相關[13]。

圖3 SchA對MPP+作用的SH-SY5Y細胞ERK和p-ERK蛋白表達水平的影響注：*與對照組比較，P<0. 05；#與MPP+比較，P<0. 05

我們通過試驗發現，在SchA干預后，SH-SY5Y細胞凋亡現象明顯減輕，凋亡細胞數減少，提示SchA具有明顯的抗凋亡作用。在此基礎上，我們進一步對SchA的抗凋亡分子機制進行了初步的研究，檢測了與細胞生長、增殖密切相關的ERK信號分子的磷酸化活性水平。實驗結果顯示，與對照組相比，MPP+染毒的SH-SY5Y細胞中ERK的活化受到明顯抑制，而給予SchA能夠促進ERK的磷酸化活化。且隨著SchA濃度的增加，p-ERK的相對表達量逐漸增加，提示ERK信號轉導通路在SchA抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞凋亡過程中起著重要的作用。

綜上所述，SchA通過促進ERK信號轉導通路的活化，從而抑制了帕金森病細胞模型的凋亡，保護了多巴胺能神經細胞，其抗凋亡的具體分子機制有待進一步深入研究。

[1] 張倫青，沙飛，崔國禎，等. 五味子木脂素類化合物的藥理學研究進展 [J]. 貴陽中醫學院學報，2014，36(4):55-58.

[2] Wei B,Li Q,Su D,etal．Development of a UFLC-MS /MS method for simultaneous determination of six lignans of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. in rat plasma and its application to a comparative pharmacokinetic study in normal and insomnic rats [J]. J Pharm Biomed Anal，2013，77(4) : 120-127．

[3] Yeh C H,Lin M W,Lin H C. Anti-neuroinflammaiton and antidepressant effects of Schisandrin B in mice [J]. FASEB J,2013,27(4) : 1 099-1 105.

[4] 劉絮，杜瑞紅，于春艷，等. 北五味子木脂素抗焦慮作用及機制的研究 [J]. 北華大學學報(自然科學版),2015,16(5): 609-612.

[5] 夏楠，王揚天，王堅. 五味子對高強度軍事訓練步兵應激系統的影響 [J]. 解放軍醫學雜志，2014，39(1)：65-69.

[6] 張國輝，王贊，邢軍，等. 五味子木脂素的抗癲癇作用及神經保護研究 [J]. 中國現代藥物應用,2014，8(4):247-248.

[7] Ba Q,Cui C,Wen L,etal. Schisandrin B shows neuroprotective effect in 6-OHDA-induced Parkinson’s disease via inhibiting the negative modulation of miR-34a on Nrf2 pathway [J]. Biomed Pharmacother,2015,75(1):165-172.

[8] 李妍,張巍,羅軍,等. 五味子甲素對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞毒性作用的影響[J]. 毒理學雜志,2013,27(1):7-10.

[9] Majd S,Power J H,Grantham H J. Neuronal response in Alzheimer’s and Parkinson’s disease: the effect of toxic proteins on intracellular pathways [J]. BMC Neurosci,2015,16(69): 1-13.

[10] Maik-Rachline G,Seger R.The ERK cascade inhibitors: Towards overcoming resistance [J]. Drug Resist Updat,2016,25:1-12.

[11] Sun Y,Zhang L,Zhang M,etal. Characterization of three mitogen-activated protein kinases (MAPK) genes reveals involvement of ERK and JNK,not p38 in defense against bacterial infection in Yesso scallop Patinopecten yessoensis [J]. Fish Shellfish Immunol,2016.

[12] Yi J H,Hye Jin Park,Beak S J,etal. Danggui-Jakyak-San enhances hippocampal long-term potentiation through the ERK/CREB/BDNF cascade [J]. J Ethnopharmacol,2015,4(175):481-489.

[13] Gyurkó M D,Steták A,S?ti C,etal. Multitarget network strategies to influence memory and forgetting: the Ras/MAPK pathway as a novel option [J]. Mini Rev Med Chem,2015,15(8):696-704.

StudyontheEffectofSchAtoERKSignalPathwayinMPP+-treatedSH-SY5YCells

LI Yan1, ZHANG Wei1, CAI Tong-jian2, ZHAO Dong-hai1, LUO Jun1, LV Shi-jie1

(1.Basic Medical College,Jilin Medical Univercity,Jilin 132013,China; 2.Preventive Medical College,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

To explore the pharmacological actions and molecular mechanisms of SchA on the apoptosis of MPP+to human neuroblastoma SH-SY5Y cells. The changes of morphological characteristics in SH-SY5Y cells were analyzed by acridine orange(AO)/ethidium bromide(EB) staining and Tunel Kit. Subsequently,ERK and p-ERK levels were analyzed by western-blot assay. Compared with control group,a marked up-regulation of apoptosis was observed in SH-SY5Y cells after being treated with 1mmol/L for 48 h. SchA intervention in each concentration group could effectively inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells. It also showed that the expression of p-ERK protein in MPP+group was significantly inhibited when compared with the negative control group , while the p-ERK level in each SchA intervention group was significantly higher when compared with MPP+exposed group(P< 0.05) A dose-dependent effect was observed. The data indicate that MPP+has the effect on promoting apoptosis in SH-SY5Y cells,and SchA can obviously alleviate the apoptosis of SH-SY5Y induced by MPP+,which may be related to the changes of ERK signal transduction pathways.

MPP+; Schisandra A ; Parkinson’s disease ; apoptosis ; ERK

LV Shi-jie

R151.2

A

0529-6005(2017)08-0050-03

2017-03-07

國家自然科學基金資助項目(81372952)；吉林省教育廳科研項目(2015407)

李妍(1974-)，女，副教授，博士，從事神經系統退行性疾病發病機制及防護研究，E-mail：liyan511700@163.com

呂士杰，E-mail：Lvshjie-qr@163.com