豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP方法的建立及應用

田 野 ，張祥斌 ， 宋延華 ， 張常明 ， 潘永飛 ， 劉佳佳 ， 賀東生

(1. 廣東溫氏食品集團股份有限公司 ， 廣東 云浮 527439 ； 2. 華南農業大學獸醫學院 ， 廣東 廣州 510642)

豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP方法的建立及應用

田 野1，張祥斌1， 宋延華1， 張常明1， 潘永飛1， 劉佳佳1， 賀東生2

(1. 廣東溫氏食品集團股份有限公司 ， 廣東 云浮 527439 ； 2. 華南農業大學獸醫學院 ， 廣東 廣州 510642)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于冠狀病毒成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。我國從1976年開始陸續有PED的報道,20世紀80年代后該病在中國流行面逐漸擴大,并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染,給養豬業造成嚴重經濟損失[1]。

環介導等溫核酸擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術依賴6條特異引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶[2-3]，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列。逆轉錄環介導等溫核酸擴增(RT-LAMP)是在原反應液中加入一定量的逆轉錄酶，可以實現RNA的一步擴增。本實驗室利用建立起RT-LAMP技術，可以為更好地防控和研究該病毒的提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株、病料和試劑 豬流行性腹瀉病毒(PEDV，GDGZ株)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV,JX株)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV,GD株)、豬細小病病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)等毒株均由本實驗保存。BstDNA聚合酶為New England BioLabs公司產品；甜菜堿(Betaine)為Sigma公司產品。

1.2 病毒核酸的提取 豬細小病病毒和偽狂犬病病毒等DNA病毒的核酸用TaKaRa DNA提取試劑盒提取。豬流行性腹瀉病毒、藍耳病病毒和傳染性胃腸炎病毒等RNA病毒的核酸用TRIZol方法提取。

1.3 豬流行性腹瀉病毒LAMP引物的設計 在GenBank獲取20株豬流行性腹瀉病毒的序列，通過對比發現M基因是該病毒保守性和特異性較好序列。將M基因序列導入LAMP引物設計軟件Primer design V3(http：//primerexplorer.jp/elamp 3.0.0/index.html)，設計出了豬流行性腹瀉病毒LAMP引物，表1。

1.4 豬流行性腹瀉RT-LAMP檢測方法的建立 RT-LAMP基本的反應體系為25 μL：1×Thermopol 緩沖液，8 mmol/L Mg2+，1 mmol/L甜菜堿，1.4 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L外引物(F3和B3)，1.6 μmol/L內引物(FIP和BIP)，0.8 μmol/L 環引物(LF和LB)，2 μL模版RNA，1U AMV逆轉錄酶，8 U Bst DNA聚合酶，20 μL石蠟封閉液。

在LAMP基本反映體系基礎上設置不同引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度，以及不同反應時間(15、25、35、45、55、65 min)和反應溫度(57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃)，獲得最佳反應參數，建立豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP檢測體系。

1.5 豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP特異性和穩定性 把PRRSV、TGEV、PPV、PRV等病毒的核酸為模板，按上述RT-LAMP體系進行檢測，分析其特異性。將PEDV的陽性病料為模板進行4次RT-LAMP，分析該方法的穩定性。

1.6 豬流行性腹瀉病的RT-LAMP方法敏感性和穩定性 以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋的豬流行性腹瀉病毒核酸為模板分別進行RT-LAMP和RT-PCR，分析其敏感性。

1.7 PEDV一步法RT-LAMP方法的臨床應用 應用建立的RT-LAMP方法對實驗室送檢的40份仔豬腹瀉病料進行檢測，同時使用常規RT-PCR方法和膠體金試劑盒進行檢測并比較試驗結果。

2 結果

2.1 豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP檢測方法的建立 研究各個因素對RT-LAMP的影響，獲得最佳反應參數(8 mmol/L Mg2+，1 mmol/L甜菜堿，1.4 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L外引物，1.6 μmol/L內引物，59 ℃，55 min)，結果見圖1，圖2。

表1 豬流行性腹瀉病毒LAMP引物

圖1 不同反應溫度LAMP結果

圖2 不同反應時間LAMP結果

2.2 豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP檢測方法的特異性和穩定性 以PPV、PRV、PRRSV、TGEV等病毒的核酸檢測RT-LAMP的特異性，如圖3.由圖3可知，豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP檢測方法只能擴增PEDV的核酸，不能擴增其他病毒的核酸，故該檢測方法具有良好的特異性。用該方法檢測4個陽性病料，均出現目的條帶，說明該方法具有穩定性。

2.3 豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP檢測方法的敏感性 以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋的豬流行性腹瀉病毒核酸為模板分別進行RT-LAMP和RT-PCR，結果如圖4。由圖4可知，RT-LAMP可以檢測到10-3稀釋的PEDV的核酸，比普通的RT-PCR靈敏性高100倍。

圖3 PEDV RT-LAMP方法的特異性和穩定性

圖4 豬流行性腹瀉病毒RT-LAMP和RT-PCR敏感性對比圖

2.4 PEDV一步法RT-LAMP方法臨床試驗結果 應用建立的RT-LAMP方法對本實驗室保存的40份仔豬腹瀉樣品進行檢測，同時使用常規RT-PCR方法和膠體金試劑盒對該病料進行檢測，結果顯示,RT-LAMP方法檢出12份陽性病料，檢出率為30%，RT-PCR方法檢出5份陽性病料，檢出率為12.5%，膠體金試劑盒檢出4份陽性病料，檢出率為10%(表2)，說明本試驗建立的RT-LAMP方法更為敏感，特異性更高。

表2 3種檢測方法臨床檢測結果

3 討論

近幾年來仔豬腹瀉，特別是有PEDV引起的病毒性腹瀉給養豬業造成巨大的經濟損失，用現有的疫苗對該病進行防控結果總是差，所以盡早發現隔離病豬可能是當下比較行之有效的防控思路。故建立一個特異性高、敏感性強，且適于豬場的檢測方法成了當務之急。本實驗室針對PEDV的M基因設計引物建立的RT-LAMP方法正好符合這種要求，通過檢測40份疑似病料，RT-LAMP的陽性檢出率30%要比膠體金試劑盒檢測(10%)和PCR(12.5%)高。而且該技術的最大優點就是無需精密的儀器，操作簡單快捷，因此適合中小型豬場對病原的快速診斷。

[1] 倪艷秀,林繼煌,何孔旺,等. 豬流行性腹瀉研究概況[J]. 畜牧與獸醫, 2001, 33(1): 38-40.

[2] Notomi T,Okayama H, Masubuchi H,etal. Loopmediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucl Acids Res, 2000,28(12)：63-68.

[3] 肖斌，朱永紅，鄒全明．簡單敏感的環介導等溫擴增基因診斷新技術[J]．中華檢驗醫學雜志，2005，28(7)：761-763.

S858.28

B

0529-6005(2017)08-0038-02

2016-07-29

吉林省經濟菌物創新平臺(2014—2016)

田野(1988-)，男，碩士生，研究方向為臨床獸醫學，E-mail：709756456@qq.com

賀東生，E-mail：dhe@scau.edu.cn