混合型雞馬立克病的鑒別及綜合診斷

孫青松 ， 劉志剛 ， 劉明遠 ， 李國江

(1.吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.預防獸醫學吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安慶師范大學生命科學學院 ， 安徽 安慶 246011 ； 4.吉林大學人獸共患病研究所教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130062)

混合型雞馬立克病的鑒別及綜合診斷

孫青松1,2， 劉志剛3， 劉明遠4， 李國江1,2

(1.吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.預防獸醫學吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安慶師范大學生命科學學院 ， 安徽 安慶 246011 ； 4.吉林大學人獸共患病研究所教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130062)

為了對吉林某土雞養殖場發生大規模的腫瘤性疾病進行診斷，經過流行病學調查、臨床癥狀檢查、病理剖檢及組織學觀察，初步診斷為禽白血病和雞馬立克病；進行實驗室鑒別診斷，設計特異性引物，利用PCR方法，經過BLAST序列比對，實驗結果確定該病為雞的馬立克病，而且同時表現出4種混合型的臨床癥狀。

雞馬立克病 ； 混合型 ； 鑒別 ； 綜合診斷

雞馬立克病(MD)是一種雞的高度接觸性淋巴組織增生性傳染病，以外周神經、性腺、虹膜、各種內臟器官、肌肉和皮膚的單核性細胞浸潤和腫瘤形成為特征，引起該病的病原為皰疹病毒馬立克氏病毒(MDV)。馬立克病根據發病的部位可分為內臟型、神經型、眼型和皮膚型，其中又以內臟型死亡率最高，臨床上常見混合性感染的病例。

馬立克病常用的檢測方法有臨床癥狀檢查、病理解剖學分析以及瓊脂擴散試驗等。近年來，該病的分子生物學診斷技術也取得了一定的進展。PCR診斷技術包括實時PCR、定量PCR、致瘤株特異性PCR、多重PCR等新技術為該病的流行病學調查、病毒在各組織器官的分布以及與其他腫瘤病毒多重感染的診斷等作出了貢獻[1-2〗。

2016年4月吉林某土雞養殖場發生大規模的腫瘤性疾病，經過流行病學調查、臨床觀察、病理解剖以及實驗室檢驗，確定該病為雞的混合型馬立克病。

1 流行病學調查

某土雞散養場引種3 000只，自2月齡開始發病，開始少量死亡，后來陸續發病死亡，母雞死亡率大于公雞，至4月齡已死亡1 245只，死亡率41.5%，發病期間曾使用過多種抗生素和抗病毒中藥進行治療，效果不理想。據養殖戶介紹此批雞種購自不同的農戶，來源比較分散，有的農戶引種時已注射過馬立克病毒疫苗，有的農戶則未免疫該疫苗。

2 臨床癥狀和病理剖檢

病雞精神委靡，食欲不振，羽毛松亂，常扎堆，拉黃白色稀糞，雞冠顏色發紺(見中插彩版圖1A)；多數雞表現神經癥狀，出現肢體癱瘓，并有“劈叉狀”姿勢，臥于一側，手觸摸病雞脫水，極度消瘦(見中插彩版圖1B)；部分雞只肉髯、雞冠部分有小米粒至黃豆大小的白色或黃色腫瘤結節，眼睛出現渾濁發白(見中插彩版圖1C)；翻開羽毛，在背部、腹部及大腿肌肉的皮膚處亦有腫瘤結節(見中插彩版圖1D、1E)。

病理剖檢可見多種臟器出現腫瘤，腫瘤多呈結節性，形狀不規則，數量不等，大小不一，略突出于臟器表面，灰白色，切面呈脂肪樣。有腫瘤的臟器主要集中在心臟(見中插彩版圖1F)、脾臟(見中插彩版圖1G)、腺胃(見中插彩版圖1H)、肝臟(見中插彩版圖1I)、腸道及肌胃等處。部分病例肝臟腫大，外觀似“啃咬狀”，表面不具有結節性樣腫瘤，呈灰白色壞死灶，向臟器里面凹陷，肝臟表面凹凸不平(見中插彩版圖1I)。腸道內膜增生，可見大小不等腫瘤性結節。腺胃外觀不規則，切開后可見不同大小的結節(見中插彩版圖1H)。

3 病理組織學檢查

采取病變部位制作石蠟組織切片，H.E.染色后，顯微鏡下觀察組織的病理學變化。結果顯示，皮膚下聚集大量淋巴樣的細胞及中央壞死灶(見中插彩版圖2A)，腺胃黏膜下及復管腺浸潤大量的腫瘤細胞(見中插彩版圖2B)，肝組織間腫瘤細胞局灶性分布(見中插彩版圖2C)，脾臟內腫瘤細胞聚集成團，中央出現壞死灶(見中插彩版圖2D)，腸黏膜下層可見大量的腫瘤細胞浸潤(見中插彩版圖2E)，腎間質散在大量的腫瘤細胞(見中插彩版圖2F)。

4 實驗室檢驗

無菌取病雞的肝臟、脾臟等器官進行處理后提取基因組，用設計的特異性引物進行PCR擴增，擴增的引物如下(鑒于是腫瘤性疾病，所以同時對白血病病毒進行了PCR檢測)：MDV-F：5′-ATGCGATGAAAGTGCTATGGAG-3′，MDV-R：5′-ATCCCTATGAGAAAGCGCTTGA-3′，ALV-F：5′-GGATGGTGGCTGACTGTGT-3′，ALV-R：5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′。

擴增體系為50 μL，其中去離子水28.5 μL，5×Primestar-DNA聚合酶緩沖液10 μL，dNTP 4 μL，primer 1和primer 2各1μL，模板DNA 5 μl，Primestar-DNA聚合酶0.5 μL；擴增條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增30個循環后，72 ℃延伸10 min。擴增后取PCR產物4 μL，在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，按照回收試劑盒說明書對產物進行回收，回收后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。PCR擴增結果顯示，可得到一條314 bp的目的條帶，MDV呈陽性(圖3)，白血病病毒結果為陰性；測序結果顯示，經BLAST比對后證實檢測到的病毒為MDV(gb[HQ149526.1])。

圖3 馬立克病毒PCR檢測結果

5 討論

在雞群中，淋巴細胞白血病、網狀內皮組織增生癥及馬立克病均可引起腫瘤的發生，雖然自20世紀60年代末火雞皰疹病毒疫苗用于生產后，已使得馬立克病的發生得到了一定控制[3]，但由于馬立克病病毒毒力的不斷增強以及疫苗免疫不當等原因，使得免疫雞群中的馬立克病仍時有暴發，這給該病的防治又帶來了新的挑戰。目前，防治馬立克病的重要措施仍是科學使用疫苗，而保持良好的環境衛生和培育抗馬立克病的新品系雞群也具有重要作用。疫苗接種后，最早7 d后才能產生堅強的免疫保護力，在接種后到產生免疫保護力之前應特別注意嚴防環境污染，以免造成雞群早期感染馬立克病病毒強毒而造成發病[4]。馬立克病病毒主要是通過水平傳播，尚無垂直傳播的有力證據[5]，因此，防止環境的病毒污染，避免雛雞早期感染最為重要，除定期消毒外，執行雞群“全進全出”飼養模式也很必要。防治馬立克病的同時，加強對其他免疫抑制性疫病的檢測和防治，可以更好地提高疫苗的免疫效果。

本次雞馬立克病的暴發可能有以下原因：第一個重要原因就是育雛雛雞來源于不同的養殖戶，疫苗接種不統一，而且個別養殖戶可能會忽視免疫疫苗的程序，或者免疫方法不當沒有起到免疫保護的作用，這樣就會極大增加了該病的發病率。二是此次暴發的馬立克病同時表現了內臟型、神經型、眼型和皮膚型4種混合感染，這種現象并不多見，其中又以內臟型死亡率最高，推測該病原毒株可能為強毒株，毒力強，致病作用明顯，而且傳播可能更迅速。三是由于飼養管理不到位，疫病防范意識差，導致該病的發生。因此應加強該病的防疫工作，選擇合適的疫苗和科學合理的免疫程序，此外，對于大部分散養戶來說，選擇合適的種源也至關重要。

本次病例是雞馬立克病4種臨床發病型的混合，4種癥狀同時出現這是并不多見的。疫病發生后，快速準確的診斷可以幫助養殖場確定最佳的治療或處理方案，最大程度的減少養殖戶的損失，本文通過流行病學調查，臨床病理變化觀察，實驗室檢驗等方法對該病暴發進行了鑒別診斷，為臨床生產解決實際問題提供借鑒和參考，從而有效的防控馬立克病的發生。

[1] 丁家波.馬立克氏病病毒pp38基因及其上游雙向啟動子的生物學特性[D].泰安：山東農業大學，2005.

[2] 龔振華，胡國明，蔣文明,等.我國馬立克氏病研究進展[J].中國動物檢疫，2012，29 (7)：63-65.

[3] Gong Z, Zhang L, Wang J,etal. Isolation and analysis of a very virulent Marek’s disease virus strain in China[J]. Virol J，2013, 5(10): 155.

[4] Tian M，Zhao Y，Lin Y,etal. Comparative analysis of oncogenic genes revealed unique evolutionary features of field Marek’s disease virus prevalent in recent years in China[J]. Virol J， 2011, 8: 121-131.

[5] Geerlig S H, Quan Z S, Suurl,etal. Efficacy and safety of cell associated vaccines against Marek′ s disease virus grown in a continuous cell line from chickens[J]. Vaccine, 2008, 26(44)：55-56.

IdentificationandComprehensiveDiagnosisofHybridChickenMarek’sDisease

SUN Qing-song1,2， LIU Zhi-gang3， LIU Ming-yuan4， LI Guo-jiang1,2

(1.Jilin Agricultural Science and Technology University，Jilin 132101, China;2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province， Jilin 132101, China;3.College of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；4.Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonoses , Jilin University，Changchun 130062，China)

A big-scale neoplastic diseases broke out in Jilin native farms, and we preliminarily diagnosed the disease as Marek’s disease or Avian leukosis by epidemiological survey, clinical examination, pathologic autopsy and histological observations. And then we confirmed that the disease was Chicken Marek’s disease by laboratory diagnosis using PCR. Meanwhile the disease showed the clinical symptoms of 4 kinds of hybrids.

Marek’s Disease ； Hybrid ； Identification ； Comprehensive Diagnosis

LI Guo-jiang

S858.31

A

0529-6005(2017)08-0029-03

2016-10-28

吉林市科技發展計劃資助項目(20166034)；吉林農業科技學院博士啟動基金項目(吉農院合字2015第243號)；吉林農業科技學院種子基金項目(吉農院合字2016第Z01號)；吉林農業科技學院校級重點學科培育項目(吉農合字2015第X055號)

孫青松(1982-)，男，講師，博士,主要從事動物疫病方面的研究，E-mail：sqswjy@163.com 劉志剛(1984-)，男，講師，碩士，主要從事動物疾病防治的研究，E-mail：xiaozhubingbingxue@ 163.com

注：劉志剛與孫青松對本文具有同等貢獻

李國江，E-mail：jlliguojiang@126.com