食源性單增李斯特菌LPXTG蛋白基因的檢測

丁 劍 ， 馬 勛 ， 陳 朔 ， 曹樹珠 ， 王貝貝 ， 杜冬冬 ， 張奇文

(石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832000)

食源性單增李斯特菌LPXTG蛋白基因的檢測

丁 劍 ， 馬 勛 ， 陳 朔 ， 曹樹珠 ， 王貝貝 ， 杜冬冬 ， 張奇文

(石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832000)

單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)作為四大重要食源性病原菌之一，對人類及多種畜禽健康威脅極大。LM細胞胞壁表面分布多種毒力蛋白，在感染機體過程中發揮重要作用，其中有一類至關重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分選酶A能夠識別基序LPXTG，共價結合到肽聚糖上，呈現在細胞表面發揮毒力作用。本試驗以不同食品中分離得到的24株單增李斯特菌為試驗對象，設計合成了41對預測含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技術進行擴增，凝膠電泳成像系統檢測擴增產物片段大小，計算24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的攜帶。結果表明，不同LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同：其中僅有12.5%(3/24)的分離株攜帶率在85%以上；不同LPXTG蛋白基因的檢出率不同，在41個檢測對象中，有8個基因的檢出率100%，有3個基因的檢出率不足20%，Lmo1115基因在所有分離株中均未檢測到。本研究對了解食品源LM分離株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意義。

單核細胞增多性李斯特菌 ； LPXTG基序表面蛋白 ； PCR

單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種胞內寄生的革蘭陽性菌，重要的食源性人獸共患病原菌之一[1]，可引起人和多種動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產等[2]。該菌在 4 ℃的環境中仍可生長繁殖，可以通過污染奶及奶制品、蔬菜、水產品、肉制品等食物導致人群感染，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一[3]。該菌分布范圍極廣，環境耐受性較強。大多數發達國家人類李斯特菌病發生率約為每100萬人2～15例，死亡率為20%～30%[4]，給人及動物的健康帶來嚴重的危害。

在LM細胞胞壁的表面分布著多種發揮重要作用的表面蛋白，這些蛋白在感染機體和適應環境的過程中發揮著重要作用。其中有一類至關重要的表面蛋白，其前體蛋白C端含有保守基序LPXTG，目前研究表明，這類蛋白由分選酶SrtA通過識別 LPXTG保守基序，將蛋白共價結合到細胞壁肽聚糖上，呈現在細胞表面發揮重要毒力作用。 本研究以不同食品中分離得到的24株單增李斯特菌為試驗對象，設計合成了41對預測含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技術進行擴增，凝膠電泳成像系統檢測擴增產物片段大小，計算24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的攜帶率。

1 材料與方法

1.1 菌株 24株食品源單增李斯特菌均分離自新疆各師局2014-2015年送檢的食品。其中LM6072小、LM6072大和LM6008分離自熟肉制品；LM2947和LM2956分離自調理雞柳；LM5470、LM5563、LM5570、LM5567、LM5573、LM3103-1、LM5474、LM3189、LM3197和LM3195分離自調理肉制品；LM3251、LM2941、LM4786、LM4788、LM502、LM2935和LM502-2分離自調理肉制品冷凍魚糜制品；LM461和LM472分離自外賣配送的盒飯。

1.2 引物 部分引物設計參照Mariscotti J F等[5]所提供的，具體如下(表1)。

1.3 主要試劑與儀器 PCR Mix、ddH2O、DL-2 000 DNA Marker，均購自廣州東盛生物科技有限公司；腦心浸液培養基(BHI)，購自青島高科技園海博生物技術有限公司；PCR儀(Bio-Rad MyCycler thermal)；電泳系統和凝膠成像系統(BIO-RAD-2000，美國)。

2 方法

2.1 菌種活化 將菌株從-80 ℃保存的甘油管接種于BHI平板，37 ℃培養24 h。

2.2 PCR反應體系和參數 PCR擴增體系：菌液2 μL；上下游引物各1 μL；2×PCR Mix 10 μL，然后加ddH2O至體積20 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個循環；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR擴增產物的電泳：瓊脂糖凝膠加EB染色后電泳，將PCR擴增產物及2 000 Marker，上樣10 μL；電壓110 V，電流60 mA，20 min后觀察電泳結果，并對其進行分析。

3 結果

PCR擴增后經1.5%瓊脂糖凝膠在TBE電泳緩沖液中進行電泳，與DS 2000相比，目的片段均與所有預期片段一致。

不同LPXTG蛋白基因的檢出率也不同，在檢測的基因中有inlA、inlJ、Lmo1413、inlH、Lmo0331、Lmo0610、Lmo1799、Lmo2085的檢出率為100%。lmo0801、Lmo0435，Lmo2026的檢出率不到20%。而Lmo1115蛋白在所有分離株中均未檢測到(表1)。

不同LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同。攜帶率最高為95.1%(39/41)，攜帶率最低為56.1%(23/41)；攜帶率在85%以上的分離株有3株，均為調理肉制品分離株；攜帶率在76%～85%之間的分離株有9株，其中4株是調理肉制品分離株，4株是冷凍魚糜分離株，1株是調理雞翅分離株；攜帶率在66%～75%之間的分離株有3株，分屬熟肉制品、調理雞柳和冷凍魚糜制品；攜帶率在65%以下的分離株有9株，其中3株調理肉制品分離株，2株是冷凍魚糜分離株，2株是熟肉制品分離株和2株盒飯分離株(表2)。

4 討論

單增李斯特菌的表面蛋白比其他G+菌的表面蛋白都要豐富。當表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分選酶A能夠識別基序LPXTG，共價結合到肽聚糖上，呈現在細胞表面發揮毒力作用。根據EDG-e株全基因組序列，發現41個帶有LPXTG基序的單增李斯特菌蛋白，其中19個蛋白同時具有LRR區[6]。研究比較清楚的有Lmo0262(InlG)、Lmo0263(InlH)、Lmo0433(InlA)、InlJ、Lmo0327、Lmo0610、Lmo0842和Lmo1413等，研究結果表明，這些表面蛋白與毒力有關[7-9]。

24株食品源LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同。其中調理肉制品分離株的攜帶率普遍較高，而熟肉制品和盒飯分離株的攜帶率普遍偏低，這是否與食品加工環節溫度有關，另外不同LPXTG蛋白基因的檢出率也不同，這與菌株的致病性是否密切相關都需要進一步的研究。

表1 41個LPXTG基序表面蛋白引物序列及檢出率

表2 24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序蛋白基因統計

“+”：有 ； “-”：無

基因名稱菌株編號LM6072小LM6072大LM3251LM2941LM502-2LM2956LM5470LM4786LM5563LM5570LM3103-1LM6008lmo2026--+---------lmo2396+-+---+--++-inlJ++++++++++++lmo0171+-++-+++-++-lmo0732+-++-+++-++-lmo0175++++++++-+++lmo0327+-----+--++-inlI++-+++++++++lmo0835+++++++-++++lmo1413++++++++++++lmo2178++++++++++++lmo2179-+++++++++++lmo0130+++++++++++-lmo0159++++++++-++-lmo0160++++++++++++inlH++++++++++++lmo0320---+-+-++--+lmo0331++++++++++++lmo0435-----+------lmo0463-+-+++-++-++lmo0514-+++++++-+++lmo0550+-++++++++++lmo0610++++++++++++lmo0627+-++-+++-++-lmo0725+++++++-++++lmo0801--+--+------lmo0842+-+---+-+++-lmo0880-++++-++++++lmo1115------------lmo1136+-++-+++-++-lmo1289---+-+-+----lmo1290-+++++++-+++lmo1666+++++++-++++lmo1799++++++++++++lmo2085++++++++++++lmo2576+-++-++++++-lmo2714++-++++-++++inlA++++++++++++inlE--++--++-++-inlF+-+++-++-++-inlG+-+---+--++-攜帶率/%70．756．180．580．561．078．082．970．756．182．985．456．1

“+”：有 ； “-”：無

目前，由LM引起的食物中毒越來越多。自1926年首次分離到本病病原后，李氏桿菌病現已呈世界性分布。近年來因食品污染本菌而引起的食物中毒病例頻繁發生，使李氏桿菌病作為一種重要的食源性傳染病在世界范圍內對食品安全及人類健康造成極大的危害[10]。我國近年來將食品中單增李斯特菌的污染檢測作為一項必檢的安全指標，WHO 將單增李斯特菌列為20世紀90年代食品中四大病原菌(致病性大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、肉毒梭菌)之一[11]。本試驗采用PCR檢測技術檢測了食品源LM分離株的LPXTG蛋白基因，為探明食品源LM的致病性有著重要的意義。

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DetectionofLPXTGproteingenesinFood-borneListeriamonocytogenes

DING Jian, MA Xun, CHEN Shuo, CAO Shu-zhu, WANG Bei-bei, DU Dong-dong , ZHANG Qi-wen

(Shihezi University School of Animal Science and Technology,Shihezi 832000, China)

Listeria monocytogenes (Lm) is well known as one of the most important foodborne pathogens, posing a great threat to the health of human and various livestock and poultry. Lm has a variety of virulence-associated proteins that are closely involved in the pathogenicity. One type of the surface proteins which have a conserved LPXTG motif at COOH-terminal cell can be cleaved by sortase and anchored peptidoglycan to present on the cell surface to play a role in virulence. Twenty-four food-borne Lm strains were isolated from different foods. Forty-one primers were designed and synthesized for putative LPXTG surface proteins. The geges were detected by PCR and gel electrophoresis imaging system. The results showed that the rate of carrying LPXTG protein genes in different LM isolates was different. And 12.5% Lm isolates(3/24)carried more than 85% LPXTG protein genes.The detection rate of LPXTG protein genes was different. Among the 41 LPXTG protein genes, only 7 genes were 100% detected ; 3 genes were under 20%; the Lmo1115 gene was not detected. It is of importance for studying the pathogenicity of food-borne Lm to test the distribution of LPXTG motif surface proteins.

Listeriamonocytogenes; LPXTG motif surface protein ; PCR

MA Xun

R378

A

0529-6005(2017)08-0017-05

2016-12-02

國家自然科學基金(31360614)

丁劍(1991-)，女，碩士生，研究方向為動物傳染病的診斷與防治，E-mail:598283567@qq.com

馬勛，E-mail:maxun779@126.com