棘球蚴基因工程亞單位疫苗免疫綿羊的效果研究

闞 威，蔡金山，趙全邦 ，沈艷麗，馬占全，胡廣衛 李 靜，王小紅，才 華

(1．青海省動物疫病預防控制中心 ， 青海 西寧 810000 ； 2．青海省貴南縣動物疫病預防控制中心 ， 青海 貴南 813100 ；3．青海省澤庫縣動物疫病預防控制中心 ， 青海 澤庫 811400)

棘球蚴基因工程亞單位疫苗免疫綿羊的效果研究

闞 威1，蔡金山1，趙全邦1，沈艷麗1，馬占全1，胡廣衛1李 靜1，王小紅2，才 華3

(1．青海省動物疫病預防控制中心 ， 青海 西寧 810000 ； 2．青海省貴南縣動物疫病預防控制中心 ， 青海 貴南 813100 ；3．青海省澤庫縣動物疫病預防控制中心 ， 青海 澤庫 811400)

采用羊棘球蚴基因工程亞單位疫苗對2 315只3～20月齡藏系綿羊進行3次免疫試驗，并用間接ELISA對免疫后的抗體進行動態監測。檢測結果顯示,首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個月的血清抗體陽性率依次為0%、98.75%、94.94%、40.74 %、98.72%、50%。同時，對同齡、同群、同草場放牧的羊三免1年后進行剖檢，免疫組59只、對照組60只。結果顯示，對照組感染率、感染強度為86.67%和3.43，免疫組感染率、感染強度為45.76%和0.86，免疫保護率(減囊率)為69.38%。

棘球蚴病 ； 棘球蚴基因工程亞單位疫苗 ； 免疫研究

棘球蚴病(Echinoccosis)俗稱包蟲病(Hydatidosis),是一種人獸共患寄生蟲病。據調查，在我國西北畜牧業發達地區的人群血清陽性率為1.06%～32%，患病率為1.0%～7.64%[1]，而我國動物感染棘球蚴病每年造成的畜產品經濟損失高達8億元以上[2]。青海省是我國棘球蚴病高發流行區，家畜和人的感染率位居全國前列。2006年，王虎等[3]調查顯示，1995-2005年青海省人與動物棘球蚴病血清陽性率和患病率逐年升高，而動物棘球蚴的血清陽性率和患病率以果洛、玉樹、黃南三州最高，海南、海北兩州次之，海東、西寧及柴達木盆地的海西州較低。2000年，蔡金山[4]等對青海省牛、羊棘球蚴病流行情況就有調查研究，其調查結果顯示，在青海省稱多、甘德、澤庫、德令哈、貴南5縣(市)羊棘球蚴感染率為53.14%，平均感染強度為4.41，牛棘球蚴感染率60.36%，平均感染強度5.59。2010年對貴南、稱多、德令哈3個縣(市)羊棘球蚴平均感染率為39.02%，平均感染強度2.4，牛棘球蚴平均感染率為33.12%，平均感染強度1.3?？傊?，近十幾年，青海省人群和動物都患有或感染不同程度的棘球蚴病，防治工作刻不容緩。本試驗旨在研究羊棘球蚴病基因工程亞單位疫苗對藏系綿羊的免疫效果，為在藏系綿羊使用該疫苗提供依據。

1 材料與方法

1.1 免疫疫苗 羊棘球蚴(包蟲)病基因工程亞單位疫苗：由重慶澳龍生物制品有限公司生產。疫苗生產批號：20121001。

1.2 試驗羊的篩選及免疫方法 結合近幾年青海省棘球蚴病流行病學調查報告，綜合分析選擇貴南縣森多鄉和澤庫縣和日鄉部分牧戶飼養的6周齡左右的新生羔羊進行免疫頸部皮下注射，并雙耳標標識。同時，在各試驗羊群設等數量、同齡、同草場放牧的羊作為對照組。試驗組羊共免疫3次，首免：6周齡第1次免疫；二免：首免4周后加強免疫1次；三免：首次免疫1年后再加強免疫1次。每次免疫后觀察7 d，通過對羊只的體溫、呼吸頻率、運動狀況、采食情況和注射部位的感官變化對疫苗的安全性進行評價。

1.3 抗體檢測時間 分別在首次免疫前、首免后1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個月采集試驗羊血樣，檢測血清抗體，共檢測血清892份。

1.4 免疫抗體檢測 應用重慶澳龍生物制品有限公司生產的羊棘球蚴(包蟲)ELISA抗體檢測試劑盒(生產批號：20141101)進行血清抗體檢測。主要操作程序：抗原包被-封閉，37 ℃，溫育60 min-洗板-加兔抗羊酶標抗體-封閉，37 ℃，溫育60 min-洗板-加底物顯色-終止反應-用酶標儀450 nm測定OD值。判定標準：樣品450 nm>0.6，判為陽性。

1.5 免疫保護效果的檢驗 三免6個月后剖檢免疫組和對照組羊共159只，其中澤庫縣對照組30只、免疫組29只，貴南縣對照組30只、免疫組30只。按寄生蟲檢查法取其肝、肺、腎、脾和心臟進行剖檢， 記錄每只羊感染棘球蚴包囊的數量、包囊大小，分別計算棘球蚴的感染率、感染強度，免疫保護率(減囊率)=(1-免疫組平均包囊數/對照組平均包囊數)×100%。

2 結果

2.1 疫苗的安全性 本試驗前后共進行3次免疫， 共免疫2～20月齡羊2 315只。在疫苗使用過程中，加入滅菌生理鹽水后溶解度好，呈均勻混濁。每次注射疫苗后觀察7 d，羊體溫、呼吸頻率、運動狀況和采食情況均正常，免疫7 d后觸摸注射部位無異常感覺，使用該疫苗免疫羊群后未出現不適反應，疫苗安全性高。

2.2 ELISA免疫抗體檢測結果 對首次免疫前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個月采集的892份血清樣品進行抗體檢測，結果顯示，2個縣首免前血清抗體平均陽性率為14.04%，首免后1周抗體平均陽性率98.75%，二免后1周陽性率為94.94%，二免1年后陽性率40.74%，三免1周后陽性率98.72%，三免6個月后陽性率為50%(表1、圖1)。

表1 ELISA免疫抗體檢測結果

圖1 ELISA免疫抗體檢測結果

2.3 血清OD值測定結果 通過ELISA法檢測定期采集的血清，按相應的免疫階段和血清抗體OD吸收值進行匯總統計，免疫組羊首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免6月后血清抗體OD吸收值有明顯的變化，其OD值與免疫羊特異性抗體呈正相關水平。從每個階段免疫羊特異性抗體的動態變化可以看出，用棘球蚴基因工程亞單位疫苗二免1周后和三免1周后血清抗體水平顯著升高，二免1年后、三免6個月后血清抗體OD吸收值為0.592和0.403，說明免疫羊群經兩次免疫一年后抗體水平開始下降(表2、圖2)，但是抗體水平依然維持在較高水平。

2.4 感染率和感染強度變化 在貴南和澤庫縣對三免后6個月的羊和對照組的羊進行剖檢，共剖檢了119只羊，免疫羊59只、對照羊60只。結果，澤庫縣30只對照羊中有26只羊感染有不同發育程度的包蟲囊，感染率為86.67%，感染強度為3.36；29只免疫羊中有12只羊感染有發育程度較低的包蟲囊，感染率為41.38%，感染強度為0.52。貴南縣30只對照羊中有26只感染有不同發育程度的包蟲囊，感染率為86.67%，感染強度為3.50，30只免疫羊中有15只羊感染有發育程度較低的包蟲囊，感染率為50.00%，感染強度為1.2。兩縣合計，對照組平均感染率為86.67%、感染強度為3.43，荷囊數為0～19 個不等，荷囊數最多的達19個，包囊直徑最大達20 mm；免疫組平均感染率為45.76%、感染強度為0.86，荷囊數為0～12個不等，最多的12個，包囊直徑最大的12 mm(表2)，免疫保護率(減囊率)為69.38%。

表2 免疫組羊血清抗體OD平均吸收值

圖2 免疫組羊血清抗體OD吸收值變化

表3 剖檢統計結果

3 討論與小結

在較長一段時間內，經國內外學者研究證實，細粒棘球蚴絳蟲六鉤蚴階段具有良好的免疫保護效果，就針對六鉤蚴階段分泌物(ES)抗原，Osborn等(1982)[5]、朱興全等(1991)[6]、哈江等(1994)[7]對羔羊進行免疫研究，研究結果顯示，該分泌物抗原對羔羊免疫后均可獲得十分理想的免疫保護效果，其免疫保護率分別為99.4%、96.04%和97.3%，Heath等[8](1996)對細粒棘球絳蟲六鉤蚴階段的分泌物抗原分析發現，其中23～25 kD 的蛋白(Eg95)成分為特異性保護抗原，并通過免疫試驗證實，羔羊可獲得93%的保護效果。因此，利用基因工程技術研制的以Eg95 重組蛋白為主要成份的疫苗，是目前世界上惟一用于預防羊棘球蚴的疫苗， 該疫苗在新西蘭、澳大利亞、阿根廷等國的綿羊免疫試驗表明，對不同棘球絳蟲蟲株的感染具有很好的免疫保護作用。

本次試驗所用疫苗由重慶澳龍生物制品有限公司生產，其主要成分是Eg95 重組蛋白，對藏羊免疫一年后血清抗體陽性率達到94.94%，一年內免疫保護率為100%，第二年的免疫保護率達到69.38%，與前述報道結果一致，對藏羊棘球絳蟲的感染具有較好的免疫保護作用，達到了通過對羊進行免疫降低棘球蚴感染率和感染強度下降的目的。雖然第二年測得的直接減囊保護率為69.38%，按照實際荷囊數、包囊大小和育囊不育囊所占的比例分析，實際保護率遠高于69.38%。為便于推廣棘球蚴(包蟲)病基因工程亞單位疫苗應用，建議采取3次免疫的免疫程序，對新生羊羔6周齡首免，間隔期1個月二免，第2年三免。

[1] Current on Chinese significance parasitosis by Department of Health to issue[C].MOH web， 2005:5：17.

[2] Extended review onechinocciasisprevalence in our country[J].Chines Journal of Epidemiology，2006，2:14-127.

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[4] 蔡金山,馬睿麟,李連芳,等. 青海省牛、羊棘球蚴病流行病學調查[J].中國動物檢疫,2013,30(1):46-47.

[5] Osborn P J ,Heath D D.Immunisation of lambs against Echinococcus granulosus using antigens obtained by incubation of oncospheres in vitro[J]. Res Vet Sci,1982, 33 :132-133.

[6] 朱興全,竇蘭清,史曉紅,等.細粒棘球絳蟲排泄分泌抗原研究-六鉤蚴排泄分泌抗原的原性[J].中國獸醫科技,1991,21(9):6-9.

[7] 哈江,吐爾洪,張壯志,等.棘球蚴(包蟲)病的預防研究[J].草食家畜,1994,(增刊):28-31.

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TheprophylacticeffectoftheSheepRecombinantHydatidsSubunitvaccineonhydatiddisease

KAN Wei1, CAI Jin-shan1, ZHAO Quan-bang1, SHEN Yan-li1, MA Zhan-quan1, HU Guang-wei1, LI Jing1, WANG Xiao-hong2, CAI Hua3

(1.Animal Disease Prevention and Control Center of Qinghai Province, Xining 810003, China ;2.Animal Disease Prevention and Control Center of GuiNan Country, Guinan 813100，China ;3. Animal Disease Prevention and Control Center of ZeKu Country, Zeku 811400，China)

This study aims to establish three immune experiments for 2315 Tibetan sheep about 3 ～ 20 months in Zeku and Guinan county of Qinghai province by using the Sheep Recombinant Hydatids Subunit vaccine, and the antibody was analyzed by Indirect ELISA dynamic monitoring. The results showed that the positive rate of primary immunization、primary immunization after a week、booster immunization after a week，booster immunization after a year,he third immune after a week and the third immune after six months serum antibody was 0,98.75%,94.94%,40.74 %,98.72% and 50%. At the same time , 59 sheep were selected from the same age, the same group, and the same free grazing pastures sheep for autopsy 1 years later the third immune, and the control number was 60. The results showed that infection rate and infection intensity of the control group were 86.67% and 3.43, infection rate and infection intensity of the immunized group was 45.76% and 0.86, and immune protection ratio was 69.38%.

Hydatid disease ; Recombinant Hydatids Subunit vaccine ; Immune research

CAI Jin-shan

S852.73+2

A

0529-6005(2017)08-0010-03

2016-11-21

中國動物疫病預防控制中心“棘球蚴病綜合防控技術集成與示范項目”

闞威(1986-)，男，獸醫師，碩士，從事動物防疫工作，E-mail：Kanweid@163.com

蔡金山，E-mail：cjshlyf@163.com