潔凈室沉降菌監測影響因素分析

廖波 吳永智 肖莉

[摘要] 目的 對潔凈室沉降菌監測中可能影響微生物生長的各種因素進行試驗分析，找出一種行之有效的操作方法。方法 按《中國藥典》2015年版四部9205要求對潔凈室沉降菌進行監測。結果 培養方式、培養基的量、沉降碟暴露時間、沉降碟放置位置對最終監測結果均有一定影響。結論 對潔凈室進行沉降菌監測時應綜合考慮各種因素的影響，以得到最客觀的監測結果。

[關鍵詞] 潔凈室；沉降菌；影響因素

[中圖分類號] R155.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2017）06（b）-0045-04

藥品潔凈實驗室應定期進行微生物檢測，內容包括非生物活性的空氣懸浮粒子數和有生物活性微生物監測，其中微生物監測包括環境浮游菌和沉降菌監測[1]。沉降菌監測不需要特殊儀器設備，方便、簡單，可操作性強，是實驗室和生產廠家采用得最多的方法。沉降菌監測照《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行[2]。微生物檢測結果的可靠性在很大程度還依賴于操作者的技術及掌握熟練程度。因此，按系統控制風險的原理，在充分控制好各環節操作的前提下，培養基的制備就突出為影響檢測結果的重要因素。目前市售的成品培養基基本用量在16 mL左右，培養時間大于3 d時普遍存在失水情況，影響檢測結果的真實可信度。實驗室用培養基多為自配使用的原因也正在于此，但據觀察發現，因受實驗室條件的限制，實驗室人員在自制培養基時的隨意較大，體現在取粉量和加水量的多少、還有加熱時間和加熱溫度的不確定性、使用量的不均勻等影響因素。該文也是基于對自制培養基過程中風險因素的可控考慮，從配制用水所致的含水量高低、注入皿內培養基的基體用量等對培養生檢測結果有影響的因素出發，以驗證控制培養基配制條件的必要性。

1 儀器、設備與材料

1.1 儀器

全自動數顯恒溫鼓風干燥箱（GZX-9246MBE）；全自動數顯生化培養箱（SPX-250B-Z）；全自動數顯立式蒸汽滅菌器（YXQ.SJ41.280）；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型）；滅菌刻度吸管、試管、Q 90 mm×15 mm培養皿等。

1.2 設備

標準潔凈室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基，批號20160121；胰酪大豆胨液體培養基，批號20160208；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號20160118；沙氏葡萄糖瓊液體養基，批號20160302）。所有制備好的培養基均照《中國藥典》2015年版（四部）1421“滅菌法”[1]操作，在121℃滅菌20 min。

1.4 驗證試驗用菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）]（貴州省食品藥品檢驗所）。所有實驗用菌種均為第三代。

2 方法

2.1 菌液制備

取經30～35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養基培養物1 mL分別加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含菌數小于100 cfu/mL的菌懸液備用。

取經20～25℃培養2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養基培養物1 mL ，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至相應濃度且含菌數小于100 cfu/mL 的菌懸液備用。

取經20～25℃培養5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養物，加2 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下孢子，轉移至另一空管，取1 mL 加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含孢子數小于100 cfu/mL 的孢子懸液備用。菌液計數結果見表1。

2.2 方法驗證

培養基適用性檢查：每次均以兩個平皿在操作臺暴露4 h作為陰性對照。比值計算公式：

2.2.1培養基失重情況考察（單位：g） ①取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟（培養基量30 mL）先在30～35℃常規預培養48 h后在潔凈室動態環境下暴露4 h，再依法培養。結果見表2。

②取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟（培養基量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后先在30～35℃預培養48 h后，在潔凈室動態環境下暴露4 h，再依法培養。結果見表3。

2.2.2培養基量對微生物生長的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟45個（培養基加入量分別為：20、30、40 mL各15個），以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露4 h后，取不同培養基量的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。結果見表4。

2.2.3暴露時間對微生物生長的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟60個（培養基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。分成4組，每組15個，在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露時間分布為1、2、3、4 h，取不同暴露時間的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。結果見表5。

2.2.4培養方式對微生物生長的影響 ①培養方式1：常規培養。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟15個（培養基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露4 h后，分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。結果見表6。

②培養方式2：密封培養。如①操作，以雙層透明無菌袋包裝燙封后續培養，結果見表6。

③培養方式3：加濕培養。如①操作，續培養期間于培養箱拖水盤中加入適量水或在培養箱中放入裝水的燒杯，每天檢查水量并及時補充，點計菌落數，取平均值計算比值。結果見表6。

3 討論

3.1 培養基失重情況考察

因為采用的沉降碟不是終端滅菌，制備好后要100%進行預培養。常規預培養后依法操作，培養基總失重平均占比情況（失重率%）結果如表7。

說明采用密封預培養能明顯減少預培養過程中的水分損失，同時在沉降菌監測中沉降碟不應放置于通風口附近。因為不同潔凈室或生產車間環境條件不一樣，受溫度濕度及層流的風速的影響，培養基失重數據會有一定波動。

3.2 培養基量干擾培養結果

培養基為20、30、40 mL驗證測得比值均在0.5～2范圍內。但培養基量以30～40 mL為宜；20 mL量較少，水份損失后對微生物生長有一定影響，例如銅綠假單胞菌，比值僅為0.59；實際操作時不可能采用量器加培養基，加量不會很精準，多于40 mL已接近培養皿上沿，操作不當可能導致培養基溢出，同時黑曲霉培養5 d后已生成較為豐富的菌絲，如接觸皿蓋，造成計數困難，且孢子一旦逸出則會導致嚴重的環境污染。

3.3 通風口附近不宜放置沉降碟

培養時間在1～4 h之間各菌驗證測得比值均在0.5～2之間，且同一種菌4個時間段的比值無顯著性差異。說明采用密封預培養、高澆注培養基及避免在通風口附近放置沉降碟后，單向氣流暴露4 h的水分損失不足以影響微生物的生長。

3.4 合理選擇需氧或厭氧培養條件

對于許多需氧微生物而言，氧氣是其呼吸作用的最終電子受體，對其生長至關重要[3]。在方式2的培養中，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉都是需氧菌，尤其是枯草芽孢桿菌在其生長過程中能迅速消耗環境中的游離氧，形成厭氧環境，使復蘇遲緩的個體無法生長，故驗證測得比值均低于0.5。只有金黃色葡萄球菌是需氧或兼性厭氧菌，在缺氧的環境中仍能維持驗證測得比值在0.5～2范圍內。

3.5 培養基含水量直接影響檢出效率

水是所有生命形式都無法或缺的。水的可利用度是由材料或液體中的水活度來反映的（水活度為在同等溫度和壓力下，某種材料上方空間內的水蒸氣與純水上方空間內的水蒸氣的壓力之比）。革蘭氏陰性菌不能在水活度低于0.97的環境中生長，而革蘭氏陽性菌則可以在水活度0.8～0.98的環境中生長。在方式3的培養中，因為提高了培養環境的相對濕度（從34%提高到66%），有效地降低了培養基在培養過程中的水分損失，從而提高了培養環境中的水活度，有利于微生物的生長，所有對照菌的驗證測得菌數均有明顯的提高，比值均提高到0.8以上。建議有條件的實驗室在檢測對象系對水含量敏感的菌類時，盡量在可調節和濕度的專業培養設備中完成培養，提高檢出效率。

3.6 兼顧沉降碟采樣時間與工作效能的平衡

考慮到單向氣流暴露4 h，培養基水分損失后是否會影響微生物的生長，藥典和GMP提出“單個沉降碟的暴露時間可以少于4 h，同一位置可使用多個沉降碟連續進行檢測并累計計數”的方法，這一方法不適應于生產企業，非無菌產品和無菌產品的生產車間需控制面積大，采用累積計數法，沉降碟成倍增加，極大增加了工作量。

綜上所述，密封預培養、高澆注培養基、遠離通風口放置、加濕續培養的聯合運用，既能滿足《中國藥典》2015年版和《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》對潔凈室沉降菌監測的要求，又能使監測結果科學、客觀、可靠。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] GB/T 16294-2010.醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法[S].北京：中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局、中國國家標準化管理委員會，2010.

[3] [英]S.P.德尼爾，等.藥物微生物學[M].北京：化學工業出版社，2007：40，46.

（收稿日期：2017-03-13）