HPLC-DAD和LC/MS/MS測定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉環市食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州 317608)

HPLC-DAD和LC/MS/MS測定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉環市食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州 317608)

目的：建立二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級桿液質聯用儀對豆奶中三聚氰胺的測定方法。方法：采用三氯乙酸和乙腈為提取劑、蛋白質為沉淀劑，提取液過凈化柱純化。結果：三重四級桿液質聯用法對三聚氰胺的檢出限為0.001 5 mg/kg，標準曲線在0.01～0.5 μg/mL范圍內，R2為0.999 8，線性良好，再回收率為85 %～89 %，適用于檢測低濃度的樣品；二極管陣列高效液相色譜法檢出限為0.024 mg/kg，標準曲線在0.5～100 μg/mL范圍內，R2為0.999 9，線性良好，回收率為83 %～91 %，可以快速地對高濃度樣品進行篩查。結論：以上兩種檢測方法結合使用，可檢測0.01～100 mg/kg的三聚氰胺含量，極大地拓寬了檢測范圍。

二極管陣列高效液相色譜；三重四級桿液質聯用；三聚氰胺；豆奶

近幾年，我國豆奶行業市場消費量逐年上升，低價豆奶充斥市場，豆奶品質令人擔憂。蛋白質含量是豆奶的重要營養指標，而三聚氰胺含氮量高，在豆奶中添加三聚氰胺可顯著提高其蛋白含量。檢測豆奶中三聚氰胺的含量能有效管控豆奶的品質，而目前對豆奶中三聚氰胺的檢測鮮有報道。

檢測三聚氰胺的方法主要有膠體金免疫層析法、可見近紅外光譜法、高效液相色譜法、氣質聯用法、液質聯用法等[1-11]。酶聯免疫法和紅外光譜法可以快速實現對三聚氰胺的定性鑒別；高效液相色譜法和氣/液質聯用法可對樣品進行定量檢測[12-14]。其中，氣質聯用法前處理過程復雜；高效液相色譜法快速、易操作，儀器較常見，能滿足一般檢測的需求，但是雜質干擾多，容易出現假陽性結果；液質聯用法靈敏度高、檢出限低，但是儀器價格昂貴、維修費用高。

2008年，我國制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值：嬰幼兒配方乳粉的限量值為1 mg/kg，液態奶(包括原料乳)、奶粉及其他配方乳粉的限量值為2.5 mg/kg。2012年7月5日，聯合國負責制定食品安全標準的國際食品法典委員會為三聚氰胺設定了新標準，液態牛奶中三聚氰胺限量值為0.15 mg/kg。本實驗研究二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級桿液質聯用儀對豆奶中三聚氰胺的測定方法，利用質譜法降低三聚氰胺的檢出限，拓寬檢測范圍，為三聚氰胺的日常檢測提供依據，為解決豆奶市場中偽劣產品帶來的安全隱患提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質聯用儀由Thermo液相系統串聯Thermo TSQ Quantiva 和 TSQ Endura三重四級桿質譜組成，賽默飛(世爾)科技有限公司；二極管陣列高效液相色譜儀由Agilent 1260液相系統和DAD檢測器組成，安捷倫科技有限公司；梅特勒XS205DH電子天平(萬分之一)，梅特勒；KQ-500DE型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；美國Organomation N-EVAP-12位水浴氮吹儀；Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；Milli-Q Direct 16超純水處理器；三聚氰胺對照品，甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、乙酸銨(HPLC)、辛烷磺酸鈉(HPLC)、三氯乙酸(AR)、氨水(AR)、檸檬酸(AR)；陽離子交換固相萃取柱凈化柱：Poly-Sery MCX。

1.2 HPLC-DAD條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流動相：離子對試劑(檸檬酸、辛烷磺酸鈉，pH=3)：乙腈=82∶18；檢測波長：236 nm；進樣量：20 μL。

1.3 LC/MS/MS條件

色譜柱：Thermo syncronis HILIC(2.1mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動相：乙酸銨(10 mmol/L，pH=3)：乙腈=40∶60；進樣量：10 μL；電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式，多反應檢測；離子噴霧電壓：4 000V；離子傳輸管溫度：350℃；霧化溫度：300℃；鞘氣流速：40Arb；輔氣流速：5Arb；停留時間：300ms；分辨率Q1：0.7FWHM；分辨率Q3：0.7FWHM；碰撞氣壓力：1.5mTorr。

1.4 樣品處理

稱取2.00 g樣品，置于50 mL離心管中，加10 %三氯乙酸15 mL、乙腈5 mL，超聲30 min，4 000 r/min離心15 min，用中速濾紙過濾后，用10 %三氯乙酸定容至25 mL；吸取10 mL，經陽離子交換固相萃取柱凈化(Poly-Sery MCX)，經50 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL流動相定容，渦旋混勻1 min，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的確定

在豆奶中添加三聚氰胺的主要作用是增加樣品的蛋白質含量，待測樣品中主要含有蛋白質。三聚氰胺是強極性的小分子化合物，溶于乙腈，乙腈能沉淀蛋白質，三氯乙酸是一種強有機酸，溶于水、乙腈等，可作為蛋白質的沉淀劑，用10%的三氯乙酸和乙腈溶液能較好地提取三聚氰胺并沉淀蛋白質。

2.2 HPLC-DAD參數的選擇

利用DAD對三聚氰胺進行200～400 nm波長掃描(附圖)。三聚氰胺在236 nm的波長下有最大吸收峰。在210 nm處雖有最大吸收峰，但是檢測波長小，樣品雜質干擾多，不利于檢測。綜上，選擇236 nm為測定波長。

附圖 三聚氰胺吸收光譜

2.3 LC/MS/MS參數的選擇

取1 μg/mL的三聚氰胺標準溶液，以流動注射的方式，注入帶電噴霧離子源的串聯質譜中，正離子模式下掃描得m/z為127的母離子，通過子離子掃描，選擇2對子離子，定量離子m/z 85、碰撞能量18V；定量離子m/z 68、碰撞能量28V，并優化相關質譜參數。

2.4 標準曲線

用流動相配置不同濃度的標準溶液，分別用二極管陣列高效液相色譜儀和三重四級桿液質聯用儀進行檢測，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，表1結果表明，兩種方法的標準曲線線性良好，R2均大于0.999，HPLC-DAD法的線性范圍為0.5～80 μg/mL，LC/MS/MS法的線性范圍為10～500 ng/mL，本實驗可以檢測三聚氰胺的濃度范圍為10ng/mL～80ng/mL。

表1 不同方法制得的標準回歸曲線

2.5 檢出限與精密度

根據3倍信噪比×稀釋倍數(2.5)/稱樣量(2 g)得三聚氰胺的檢出限，10倍信噪比×稀釋倍數(2.5)/稱樣量(2 g)得其定量限。分別取0.5 μg/mL和0.01 μg/mL的標準溶液分別進HPLC-DAD和LC/MS/MS分析，平行進樣6次，計算三聚氰胺的保留時間精密度和峰面積精密度。表2結果表明，兩種方法的保留時間和峰面積精密度均小于2 %，方法的精密度良好。HPLC-DAD法的檢出限是LC/MS/MS法檢出限的16倍，LC/MS/MS法能極大地降低樣品的檢出濃度。

表2 檢出限、定量限和精密度試驗結果

2.6 回收率

在空白豆奶中添加三聚氰胺標準溶液(表3)。樣品中三聚氰胺含量為2～6 mg/kg時，HPLC-DAD檢測的回收率為85%～89%；樣品中三聚氰胺含量為0.04～0.12 mg/kg時，LC/MS/MS檢測的回收率為83%～91 %。

表3 回收率試驗結果

3 結論

建立了HPLC-DAD和LC/MS/MS測定豆奶中三聚氰胺的方法。利用這兩種方法能簡單快速檢測三聚氰胺殘留量，且靈敏度高，時間短。本研究利用LC/MS/MS法降低了三聚氰胺的檢出限，采用質譜SRM的掃描方式進行定量分析，抗干擾能力強，適用于豆奶樣品三聚氰胺含量的檢測。◇

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Determination on Melamine in Soy Milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS

YOU Yan

(The Inspection Testing Center of Food and Drug in Yuhuan City，Taizhou 317608，China)

【Objective】 To establish a method for the melamine in soy milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS.【Method】 we used trichloroacetic acid and acetonitrile to extract and precipitate impurities.The Extraction was purificated by purification column.【Result】 Using LC/MS/MS method，the detection limit was melamine was 0.001 5 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.01～0.5 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 8.The recoveries ranged from 85%～89%.The method was applicable to detect low concentration of sample.While using HPLC-DAD method，the detection limit of melamine was 0.024 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.5～100 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 9.The recoveries ranged from 83%～91%.It was suitable for high concentration of the detection of the sample.【Conclusion】 The two kinds of detection methods used in combination could detect 0.01～100 mg/kg of melamine，greatly expand the detection range.

Diode Array High Performance Liquid Chromatography (HPLC-DAD)；Triple Level 4 Pole Liquid Ms(LC/MS/MS)；melamine；soy milk

尤妍(1986— )，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測。

(責任編輯 唐建敏)