GRIM-19在子宮腺肌病中的表達及促進疾病發展的機制研究

蔣 靜，陳 燕，吳 宏

(川北醫學院附屬醫院婦產科，四川南充 637000)

GRIM-19在子宮腺肌病中的表達及促進疾病發展的機制研究

蔣 靜，陳 燕，吳 宏

(川北醫學院附屬醫院婦產科，四川南充 637000)

目的研究誘導細胞凋亡相關基因-19(GRIM-19)在子宮腺肌病患者子宮內膜組織中的表達水平，并探討其在疾病發生發展中的分子機制。方法取30例子宮腺肌病患者異位和在位內膜組織，采用免疫組織化學和Western blot檢測內膜組織中GRIM-19、磷酸化信號轉導及轉錄激活蛋白3(pSTAT3)和內皮生長因子(VEGF)的表達水平。采用TUNEL檢測內膜組織凋亡，CD34抗體直接檢測內膜組織新生血管形成。構建GRIM-19 siRNA和重組質粒，轉染Ishikawa細胞后檢測下游信號分子pSTAT3、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)和VEGF的變化。結果與對照組相比，子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中GRIM-19表達水平降低。在位內膜和異位內膜組織中細胞凋亡減少，微血管密度、pSTAT3和VEGF表達水平升高。轉染Ishikawa細胞，下調GRIM-19表達可顯著激活pSTAT3和VEGF。結論GRIM-19通過抑制細胞凋亡和增加新生血管形成，促進子宮腺肌病的發生發展。

凋亡誘導因子；子宮腺肌病；凋亡；血管生成

子宮腺肌病是育齡女性常見的婦科疾病，由子宮內膜腺體和間質侵襲至子宮肌層，并引起肌層顯著增厚。目前子宮腺肌病的病因及發病機制尚未完全明確。誘導細胞凋亡相關基因(GRIMs)是一種近年來研究發現的由干擾素/維甲酸合并誘導的細胞凋亡基因編碼，通過反義RNA敲除技術篩選出的凋亡蛋白[1]。誘導細胞凋亡相關基因-19(GRIM-19)是GRIMs家族成員之一，在多種正常組織中表達，而在腫瘤如腎透明細胞癌和前列腺癌中GRIM-19表達明顯降低[2]。GRIM-19可與信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)結合并抑制其轉錄活性[3]。持續活化的STAT3可抑制細胞凋亡，并直接上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達，刺激新生血管形成[4]。研究GRIM-19在子宮腺肌病患者內膜組織中的表達水平，并探索其在疾病發生發展過程中的作用及機制，可能為子宮腺肌病的治療提高新的靶點。

1 材料與方法

1.1標本收集 子宮內膜標本選取本院2014年1月至2015年12月經腹或腹腔鏡子宮切除術患者中經病理證實的30例子宮腺肌病患者(年齡31～41歲，體質量指數17.66～29.4 kg/m2，增殖期子宮內膜17例，分泌期子宮內膜13例)，10例非子宮腺肌病患者(年齡33～39歲，體質量指數18.8～26.8 kg/m2，增殖期子宮內膜6例，分泌期子宮內膜4例)。本研究獲得本院倫理委員會批準，納入研究的患者均簽署知情同意書。排除標準：近3個月口服避孕藥或其他激素藥物；子宮內膜癌；盆腔子宮內膜異位癥；子宮肌瘤；卵巢囊瘤。收集的子宮內膜標本分別保存于液氮和4%甲醛固定。

1.2TUNEL法檢測細胞凋亡 制備內膜組織石蠟包埋切片，利用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche)進行脫蠟、漂洗、蛋白酶K處理、固定和封閉。設置陽性對照和陰性對照，配置Dnasel反應液，孵育并滴加100 μL TdT酶反應液標記，避光孵育60 min后滴加DAB顯色液，漂洗后中性樹膠封片。在400倍光學顯微鏡下隨機選擇5個視野計數TUNEL染色陽性細胞。

1.3免疫組織化學 收集內膜組織甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，脫蠟后加入定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液和3%H2O2，用血清封閉后滴加一抗，GRIM-19單抗(Abcam，1∶500)、pSTAT3單抗(Abcam，1∶100)、VEGF抗體(Abcam，1∶150)、CD34單抗 (Zhongshan，1∶100)，4 ℃孵育過夜。沖洗后滴加二抗，孵育30 min后沖洗顯色，復染后封片。采用Image Pro-plus進行免疫組織化學吸光度測量。

1.4蛋白提取及Western blot 使用Tissue Protein Extraction Reagent(Cwbio)提取內膜組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，50 μg/孔上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉膜封閉，孵育抗體并顯色。抗體稀釋濃度如下：GRIM-19 (Abcam∶mAb，1∶1 000)，pSTAT3(Abcam∶mAb，1∶5 000)，STAT3(Abcam∶mAb，1∶1 000)，VEGF (Abcam∶pAb，1∶1 500)，GAPDH(Abcam∶mAb，1∶3 000)。

1.5細胞培養及細胞轉染 Ishikawa細胞購自中國科學院上海生物科學院細胞資源中心，采用DMEM培養基和10%FBS培養。pEGFP-N1、GRIM-19重組質粒(pEGFP-N1-GRIM-19)和FAM-siRNA、GRIM-19-siRNA(5′-GGAUUGGAACCCUGAUCUATT-3′)均由上海吉凱基因合成及鑒定。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染細胞，轉染后6 h更換培養基，熒光顯微鏡下檢測轉染效率。轉染后48 h提取細胞蛋白進行Western blot檢測。

2 結 果

2.1子宮腺肌病患者內膜組織中GRIM-19的表達 采用免疫組織化學方法檢測子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織以及對照組子宮內膜中GRIM-19表達水平。結果顯示GRIM-19染色主要位于子宮內膜腺上皮細胞，子宮腺肌病患者內膜組織中GRIM-19表達明顯低于對照組(P<0.05)，并且子宮腺肌病患者異位內膜組織中GRIM-19表達低于在位內膜組織，差異具有統計學意義，見圖1A。Western blot檢測發現：子宮腺肌病患者在位內膜GRIM-19蛋白表達較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖1B。

2.2子宮腺肌病患者內膜組織中細胞凋亡情況 采用TUNEL實驗檢測子宮腺肌病患者內膜組織細胞凋亡情況。與對照組內膜組織相比，子宮腺肌病患者在位和異位內膜組織中凋亡細胞數明顯減少(P<0.05)，其中異位病灶內膜組織中凋亡細胞數少于在位內膜組織，見圖2。不同內膜組織中凋亡細胞數不隨月經周期而改變，增殖期和分泌期子宮內膜凋亡細胞數差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3子宮腺肌病內膜組織VEGF表達和新生血管形成 疾病發生發展過程中，VEGF通過刺激血管內皮細胞增生促進血管新生。本實驗中采用免疫組織化學法檢測內膜組織中VEGF的表達，通過檢測新生血管內皮細胞標志物CD34表達來確定內膜組織中微血管密度。結果顯示，增殖期和分泌期子宮內膜組織中染色的VEGF主要位于腺上皮細胞內。與對照組內膜組織相比，子宮腺肌病患者在位和異位內膜組織中VEGF表達明顯升高(P<0.05)，其中異位病灶內膜組織中VEGF表達量最高，見圖3A。3組內膜組織中，增殖期與分泌期子宮內膜VEGF表達無明顯統計學差異。Western blot檢測發現：子宮腺肌病患者在位內膜VEGF蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖3B。與對照組內膜相比，子宮腺肌病患者異位內膜組織中微血管密度明顯升高，見3C。

2.4GRIM-19通過STAT3調控VEGF表達 采用免疫組織化學法檢測內膜組織中pSTAT3表達。結果顯示對照組內膜組織中pSTAT3主要位于子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞，子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中pSTAT3主要位于腺上皮細胞。在位內膜和異位內膜組織中pSTAT3表達明顯高于對照組(P<0.05)，見圖4A。Western blot檢測發現：子宮腺肌病患者在位內膜pSTAT3蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.05)，而兩組總STAT3蛋白差異無統計學意義，見圖4B。

A：子宮腺肌病患者在位、異位內膜組織和對照組正常內膜組織中GRIM-19免疫組織化學染色×400光鏡圖及染色陽性細胞平均密度分數；B：子宮腺肌病患者在位內膜組織和對照組正常內膜組織中GRIM-19蛋白表達及蛋白相對表達量柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖1子宮腺肌病患者內膜組織中GRIM-19的表達情況

A：子宮腺肌病患者內膜組織和對照組內膜組織TUNEL凋亡染色(×400)，黑色箭頭所示為凋亡細胞TUNEL染色陽性。B：不同組織中TUNEL染色陽性細胞數。*：P<0.05，**：P<0.01

圖2子宮腺肌病患者內膜組織細胞凋亡情況

A：子宮腺肌病患者內膜組織和對照組內膜組織VEGF免疫組織化學染色(×400)和染色陽性細胞平均密度分數；B：子宮腺肌病患者在位內膜組織和對照組正常內膜組織中VEGF蛋白表達及蛋白相對表達量柱狀圖；C：子宮腺肌病患者內膜組織和對照組內膜組織CD34免疫組織化學染色(×200)和微血管密度統計分析柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖3子宮腺肌病患者內膜組織VEGF表達和微血管密度分析

A：子宮腺肌病患者在位、異位內膜組織和對照組正常內膜組織中pSTAT3免疫組織化學染色(×400)及染色陽性細胞平均密度分數；B：子宮腺肌病患者在位內膜組織和對照組正常內膜組織中pSTAT3和總STAT3蛋白表達及蛋白相對表達量柱狀圖。*:P<0.05，**:P<0.01

圖4子宮腺肌病患者內膜組織中pSTAT3的表達情況

A：Ishikawa細胞轉染GRIM-19 siRNA和Control siRNA 48 h后GRIM-19、pSTAT3、STAT3和VEGF蛋白表達及蛋白相對表達量柱狀圖；B：Ishikawa細胞轉染pEGFP-GRIM-19和空載pEGFP后×400熒光和普通鏡光鏡圖；C：Ishikawa細胞轉染pEGFP-GRIM-19和空載pEGFP 48 h后GRIM-19、pSTAT3、STAT3和VEGF蛋白表達及蛋白相對表達量柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖5上調和下調GRIM-19對pSTAT3和VEGF表達的影響

小干擾RNA(GRIM-19 siRNA和Control siRNA)轉染Ishikawa細胞。Western blot結果顯示相較于空白對照組，轉染GRIM19 siRNA后Ishikawa細胞表達GRIM-19明顯減少(P<0.05)，而pSTAT3及其下游VEGF表達明顯增加(P<0.05)，見圖5A。Ishikawa細胞轉染pEGFP-GRIM-19上調GRIM-19表達，熒光顯微鏡下評估轉染效率，見圖5B。與空載質粒相比，轉染pEGFP-GRIM-19后細胞表達GRIM-19明顯增加(P<0.05)，pSTAT3和VEGF表達減少(P<0.05)；總STAT3表達在兩組細胞內差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5C。

3 討 論

子宮腺肌病的發病機制較為復雜。解剖上子宮內膜基底層缺乏黏膜下層，使得子宮內膜腺體和間質易于侵入子宮肌層，并在肌層內形成異位病灶。然而，觸發子宮內膜“侵襲”子宮肌層的具體機制尚未完全明確。Chen等[5]研究發現在異位病灶組織內存在一系列形態功能改變，包括細胞增殖、細胞凋亡和新生血管的形成等。這些功能改變增強了異位病灶內腺上皮細胞和間質細胞的侵襲能力，使得異位的內膜組織更易在子宮肌層內“擴散轉移”。研究發現，Ki-67是一種細胞增殖常用標記蛋白，在子宮腺肌病內膜間質細胞內呈高表達[6]。因此，子宮內膜細胞異常的細胞增殖和細胞凋亡可能明顯影響子宮腺肌病的發展過程。同時，異位內膜病灶的建立需要新生血管形成并供給血液[7]。在本研究中，筆者檢測了子宮腺肌病患者內膜組織中GRIM-19的表達以及細胞凋亡和新生血管形成情況，發現GRIM-19通過調控細胞凋亡和血管形成，在子宮腺肌病的發病機制中起著重要作用。

本研究中，筆者發現子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中細胞凋亡數量顯著減少，這與Taguchi等[8]的研究結果一致。這些結果提示抑制細胞凋亡可能是子宮腺肌病發生過程中一個重要的步驟。有研究發現高表達GRIM-19可增強IFN-維甲酸介導的細胞凋亡過程。眾多研究提示GRIM-19對細胞凋亡和細胞生長有重要影響。另外，GRIM-19在抑制腫瘤生長的過程中也起著關鍵作用，GRIM-19等位基因的缺失可增加活體細胞腫瘤易感性[9]。Hao等[10]研究發現低表達GRIM-19可顯著增強肝癌細胞黏附和侵襲能力，而Huang等[11]的研究結果提示上調GRIM-19表達可抑制胃癌細胞SGC-7901的黏附、遷移和侵襲過程。本研究中，子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中GRIM-19表達顯著減少。這些結果提示，內膜腺上皮細胞低表達GRIM-19可介導細胞凋亡減少，從而誘導腺體和間質侵襲至內膜肌層交界區甚至子宮肌層，導致子宮腺肌病的發生。

為了進一步探討GRIM-19介導細胞凋亡的分子機制，筆者檢測了GRIM-19相關基因STAT3的表達。Bu等[3]發現GRIM-19通過下調細胞增殖和凋亡相關基因表達，抑制STAT3介導的細胞轉化和有絲分裂等過程。本實驗中，子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中存在STAT3的異常激活，且GRIM-19呈相應的低表達。同本研究結果一致，Yue等[12]發現在宮頸癌細胞中GRIM-19低表達與pSTAT3的過度活化密切相關。pSTAT3在腫瘤生長和轉移過程中具有重要作用。STAT3的磷酸化過程主要受上游酪氨酸激酶調控，包括細胞因子、生長因子、非受體酪氨酸激酶等。GRIM-19通過介導v-Src可顯著減少pSTAT3及下游相關基因的表達，如c-myc、cyclin B1和cyclin D1等[13]。這些結果提示，GRIM-19可通過抑制pSTAT3活化，從而減少子宮腺肌病內膜細胞凋亡和生長。

VEGF作為新生血管形成過程中重要的因子，也是STAT3下游靶基因蛋白。有研究發現在子宮腺肌病患者在位內膜和異位內膜組織中VEGF水平顯著升高[14]，同本研究結果一致。組織芯片研究發現，在胃癌細胞中pSTAT3與VEGF的表達存在相關性，高表達的pSTAT3通過介導VEGF啟動子活性影響VEGF的表達[15]。本實驗中，下調GRIM-19的表達可激活pSTAT3，促進其下游VEGF表達。

綜上所述，低表達的GRIM-19可能通過調節GRIM-19-STAT3-VEGF信號通路，抑制細胞凋亡，加快新生血管形成，從而促進子宮腺肌病發生發展。GRIM-19可能成為子宮腺肌病的治療新靶點。

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ExpressionofGRIM-19inadenomyosisanditsmechanismforpromotingdiseaseprogress

JiangJing,ChenYan,WuHong

(DepartmentofObstetricsandGynecology，AffiliatedHospitalofChuanbeiMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo study the expression level of GRIM-19 in endometrial tissue of the patients with adenomyosis and to investigate its molecular mechanism during disease occurrence and progress process.MethodsThe ectopic and eutopic endometrial tissues were obtained from 30 patients with adenomyosis.Immunohistochemistry and Western blot were performed to detect the expression of GRIM-19,pSTAT3 and VEGF.The endometrial tissue apoptosis was assayed by TUNEL.Immunohistochemistry with anti-CD34 antibody was performed to detect angiogenesis in endometrial tissue.GRIM-19 small interfering RNA(siRNA) and recombinant GRIM-19 plasmid were constructed and transfected into Ishikawa cells for detecting the change of downstream signal molecules pSTAT3,STAT3 and VEGF.ResultsThe expression level of GRIM-19 was decreased in the ectopic and eutopic endometrial tissues of patients with adenomyosis compared with control group.Apoptosis in ectopic and eutopic endometrial tissues was reduced;the microvessel density and expression levels of pSTAT3 and VEGF were increased.Transfecting Ishikawa cells and down-regulating GRIM-19 expression could significantly activate pSTAT3 and VEGF.ConclusionGRIM-19 promotes the occurrence and development of adenomyosis by inhibiting apoptosis and angiogenesis.

apoptosis inducing factor;adenomyosis;apoptosis;angiogenesis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.021

R711

A

1671-8348(2017)27-3811-05

2016-12-16

2017-05-14)

蔣靜(1973-)，碩士，副教授，主要從事婦產科疾病的高強度聚集超聲治療。