銀杏葉提取物對腸炎小鼠腸黏膜屏障的保護作用研究*

趙紅偉，和麗麗，韓 華，岳月紅，康 薇，朱葉珊，劉建平

(1.河北省人民醫院消化內科，石家莊 050051;2.河北省人民醫院老年病科，石家莊 050051；3.河北省人民醫院婦科，石家莊 050051；4.河北省人民醫院神經內科，石家莊 050051；5.河北省新樂市醫院消化內科 050700；6.河北省唐山市中醫院脾胃科 063000；7.河北省中醫院脾胃科，石家莊 050071)

銀杏葉提取物對腸炎小鼠腸黏膜屏障的保護作用研究*

趙紅偉1，和麗麗2，韓 華3，岳月紅4，康 薇5，朱葉珊6，劉建平7△

(1.河北省人民醫院消化內科，石家莊 050051;2.河北省人民醫院老年病科，石家莊 050051；3.河北省人民醫院婦科，石家莊 050051；4.河北省人民醫院神經內科，石家莊 050051；5.河北省新樂市醫院消化內科 050700；6.河北省唐山市中醫院脾胃科 063000；7.河北省中醫院脾胃科，石家莊 050071)

目的探索銀杏葉提取物(EGB 761)對腸炎模型小鼠結腸黏膜屏障的保護作用。方法將30只小鼠分為正常對照組、模型組、EGB 761組，建立動物模型；每天觀察小鼠的一般情況、體質量變化、糞便隱血及結腸組織病理學的表現，免疫組織化學熒光染色測定結腸組織中occludin-1等緊密連接蛋白的變化。結果模型組小鼠體質量下降，飲水和進食明顯減少，EGB 761干預治療后小鼠的體質量回升明顯；EGB 761組可見炎癥細胞浸潤少，炎癥程度較模型組明顯減輕。模型組結腸黏膜組織緊密連接蛋白-1(claudin-1)、occludin和zo-1熒光分布較正常對照組分散，熒光強度減弱，邊緣粗糙；經EGB 761干預后EGB 761組熒光仍沿細胞膜分布，強度較正常對照組稍減弱，但仍強于模型組。結論EGB 761能有改善腸炎模型小鼠結腸組織炎性反應，其機制可能與加強其腸黏膜屏障的保護作用有關。

銀杏葉提取物；潰瘍性結腸炎；急性期動物模型；腸黏膜屏障

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復發作的腸道炎癥性疾病，嚴重影響患者的生活質量，目前對于UC的發病機制尚不十分清楚，但更多的研究更傾向于有害物質或病毒穿過腸道的黏膜屏障，與機體本身的免疫系統反復接觸及刺激，使機體免疫發生異常變化，從而產生大量的免疫炎性因子，使腸道發生炎性反應[1-3]。銀杏葉提取物(ginko biloba extract，GBE 761)的活性成分包括銀杏內酯、白果內酯，這些銀杏黃酮-糖甙成分具有強大的清除自由基、抗氧化能力，但其是否對腸黏膜屏障有調節作用仍需進一步研究。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 30只C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量20～22 g；9～12周齡； EGB 761(金鈉多注射液,德國威瑪舒培藥廠)；右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS,美國Sigma)；兔抗zo-1抗體(Invitrogen)、 鼠抗occludin抗體(美國Santa Cruz)、HRP 抗鼠IgG 、HRP 抗兔IgG (北京中杉有限公司)；將10 g DSS (相對分子質量36 000～50 000)溶于500 mL蒸餾水中后配成了2%濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2造模方法 30只C57BL/6雄性小鼠按隨機數字表法分為正常對照組(10只)、模型組(10只)、EGB 761組(10只)；模型組、EGB 761組、自由飲用2% DSS 7 d；正常對照組、自由飲用蒸餾水7 d,EGB 761組每天予EGB 761 1 mL(200 mg/kg)灌腸，正常對照組和模型組給予PBS灌腸，時間均為1周，第8天處死所有動物。

1.3動物的一般情況及疾病活動指數(disease activity index,DAI) 實驗開始時，需要每天觀察動物的飲食、飲水、精神狀態、體質量、毛發光澤度、活動情況、大便性狀等。按照DAI評分標準評估各組小鼠DAI的變化，DAI=(體質量指數+大便形狀+出血情況)/3。

1.4結腸組織大體評分及結腸病理組織染色(HE染色) 在實驗結束后，取部分結腸組織，固定、包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察腸組織的病理學改變。

1.5結腸組織免疫組織熒光染色 將新鮮結腸組織切片、固定、封閉，室溫放置1 h，加小鼠抗緊密連接蛋白-1(claudin-1)和occludin單克隆抗體，兔抗zo-1多克隆抗體，4 ℃過夜，洗滌液沖洗，滴加標記綠色熒光的抗兔FITC或標記紅色熒光的抗小鼠Cy3，室溫放置1 h顯示紅色熒光或綠色熒光為陽性表達。用PBS替代一抗作陰性對照，其余步驟同上。

2 結 果

2.1實驗動物DAI變化情況 模型組小鼠體質量、飲食、大便情況的變化：實驗第1天，飲用了2%DSS后，觀察小鼠的進食及飲水均較多，體質量增加；實驗第3天，飲用了2%DSS的模型組小鼠出現體質量有所下降，大便偏松散且量有所增加，但無黏液及膿血，動物的進食和飲水均明顯減少；實驗第5天，模型組出現小鼠的體毛較凌亂，毛發無光澤，精神萎靡，進食及飲水較之前明顯減少，體質量較之前有所下降，同時可見大便偏稀，帶有黏液及膿血；實驗第8天，模型組小鼠精神差，毛較凌亂，進食及飲水減少，體質量下降，同時肛周可見肉眼血便。正常對照組小鼠的飲食、體質量、大便情況的變化：正常對照組從第1～8天小鼠毛發、精神、活動、大便，體質量持續增加。EGB 761組小鼠的飲食、體質量、大便情況的變化：應用EGB 761 1 mL(200 mg/kg)灌腸干預實驗小鼠治療的第2天，小鼠的精神尚可，進食及飲水正常，體質量未下降，可見排稀便；EGB 761干預UC小鼠的第5天，小鼠精神狀態好，毛發有光澤，飲食及飲水量增加，小鼠的體質量較模型組也有明顯增加，大便較稀且量較多；EGB 761干預UC小鼠第7天，EGB 761組小鼠進食及飲水較模型組明顯增多，同時體質量也明顯上升，動物的精神狀態良好，毛發有光澤，大便量多，無黏液及膿血。實驗結束后，綜合計算各組動物的大便潛血、大便性狀、體質量等情況進行DAI評分：在實驗第5天，與正常對照組動物DAI評分(0.00±0.00)比較，模型組動物DAI評分明顯升高(1.30±0.65，P<0.01)，至實驗第8天模型組DAI評分升高最為明顯(3.00±0.41，P<0.01)，見圖1。

2.2各組動物結腸黏膜組織病理學表現 實驗結束后，蠟塊切片行HE染色，可見模型組小鼠結腸組織上皮破損或缺損，黏膜層及結腸黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤，同時伴有隱窩增生。正常對照組結腸病理切片可見結腸組織上皮完整且黏膜光滑，黏膜層及黏膜下層無充血、水腫等表現；EGB 761組可見結腸組織上皮的破損不明顯，黏膜層及黏膜下層的炎癥細胞浸潤較少，隱窩增生形成不明顯，其炎癥程度較模型組明顯減輕，且EGB 761組結腸病理表現較模型組隱窩破壞、病變深度、炎癥浸潤均有不同程度的減輕，見圖2。

圖1 各組小鼠DAI評分比較

A：模型組；B：正常對照組；C：EGB 761組

圖2各組動物結腸黏膜組織病理學的表現(HE染色×200)

2.3免疫熒光染色檢測結腸黏膜claudin-1、occludin、 zo-1蛋白的定位分布 實驗結束后，行冰凍切片熒光染色，claudin-1、occludin、zo-1等緊密連接蛋白的抗體均帶有熒光標記物，claudin-1、occludin抗體帶有紅色熒光標記物，zo-1抗體帶有綠色標記物，通過熒光顯微鏡可見模型組結腸組織熒光染色后claudin-1、occludin陽性蛋白表達呈現紅色顯像，結腸組織細胞與細胞緊密連接處紅色熒光分布不連續、不整齊且較零亂，邊緣粗糙呈鋸齒狀；同時紅色顯色面積減少，且熒光強度減弱；正常對照組結腸黏膜claudin-1、occludin陽性蛋白紅色熒光在結腸細胞與細胞連接處呈連續性分布、邊緣光滑，紅色顯色面積較大，熒光強度增強；EGB 761組claudin-1、occludin陽性蛋白紅色熒光在結腸細胞與細胞連接處沿胞膜分布，呈連續性分布、邊緣較光滑，紅色顯色面積較模型組大，紅色熒光強度較正常對照組稍減弱，但仍強于模型組。通過熒光顯微鏡可見模型組結腸組織熒光染色后zo-1陽性蛋白表達呈現綠色顯像，結腸組織細胞與細胞緊密連接處紅色熒光分布不連續、不整齊且較零亂，邊緣粗糙呈鋸齒狀；同時綠色顯色面積減少，且熒光強度減弱；正常對照組結腸黏膜zo-1陽性蛋白綠色熒光在結腸細胞與細胞連接處呈連續性分布、邊緣光滑，綠色顯色面積較大，熒光強度增強；EGB 761組zo-1陽性蛋白綠色熒光在結腸細胞與細胞連接處沿細胞膜分布，呈連續性分布、邊緣較光滑，綠色顯色面積較模型組大，綠色熒光強度較正常對照組稍減弱，但仍強于模型組，見圖3～5。

A：模型組；B：正常對照組；C：EGB 761組

圖3各組小鼠結腸黏膜組織claudin-1的表達(免疫熒光染色×200)

A：模型組；B正常對照組；C：EGB 761組

圖4各組小鼠結腸組織occludin的表達(免疫熒光染色×200)

A：模型組；B正常對照組；C：EGB 761組

圖5各組小鼠結腸組織zo-1的表達(免疫熒光染色×200)

3 討 論

隨著生活水平的提高，人們的飲食結構也隨之改變，多方的調查研究發現，UC的發病率較以前明顯上升，嚴重影響患者的生活質量，所以UC的治療成為亟待解決的問題。目前對于UC的發病機制尚不十分清楚，但是多數研究認為更多的有害物質或病毒穿過腸道的黏膜屏障，與機體本身的免疫系統反復地接觸及刺激，使機體的免疫發生異常變化，從而產生大量的免疫炎性因子，不斷刺激腸道，使腸道發生炎性反應，造成腸道的黏膜水腫、出血、糜爛等癥狀。由此可見腸道的黏膜屏障起到了關鍵性的作用。

腸黏膜屏障在正常情況下是腸道的保護性屏障，它把有害物質與機體分開，避免機體受到侵害，完整的腸道黏膜屏障是由腸道上細胞連接而成的，細胞與細胞之間有緊密連接蛋白，這種蛋白之間的緊密連接是其主要的連接方式，對細胞的連接及屏障形成的完整性起著決定性的作用[4-5]。在正常情況下，結腸組織黏膜能有效阻止有害菌穿透黏膜進入深部組織，腸道黏膜上皮的完整性是腸道黏膜屏障的結構基礎，有利于機體的內環境穩定，是機體健康的保證[6-9]。如果有害物質對細胞與細胞之間的緊密連接蛋白造成損害，使細胞與細胞之間的連接不緊密、不連貫，有破損、裂縫，使屏障的保護作用降低，此時有害物質能穿過細胞之間連接的屏障對機體的免疫系統不斷地進行刺激，引起機體免疫紊亂，炎癥產生，最終導致UC的發生。由此可見，緊密連接蛋白的連貫性、黏膜屏障的完整性，在腸道保護方面起著重要的作用。

西醫主要采用糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑治療UC，但是同時也會伴發嚴重的不良反應，給患者帶來了痛苦。在中醫方面關于UC的研究也較多，取得的成果也較顯著，銀杏是中國較為古老的一種植物，銀杏葉中含有苦內酯、天然活性黃酮等對人體健康有益的多種成分，在UC的研究中也顯示了很大的作用。GBE 761具有擴張血管、溶解膽固醇、改善血液循環、清除自由基、清除過氧化脂質、保護組織等作用。也有研究表明，GBE 761可抑制炎性細胞因子的表達，對大鼠實驗性結腸炎具有抑制腸道炎癥，保護腸道作用，但在GBE 761治療UC的緊密連接蛋白的連貫性、黏膜屏障的完整性方面的研究較少。

綜上所述，應用GBE 761干預UC小鼠可以使UC小鼠血便減少，腹瀉減輕，進食增加，精神萎靡癥狀減輕，病理結果及免疫熒光檢查顯示，GBE 761干預UC小鼠可以恢復緊密連接蛋白的連貫性、減少緊密連接蛋白破損，使腸黏膜完整性增加，減少腸道出血，小鼠的進食及體質量逐漸增加，UC癥狀首先獲得改善。

[1]Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al.Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J].Gut,2015,64(2):222-232.

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[5]Coskun M.Intestinal epithelium in inflammatory bowel diseases[J].Front Med (Lausanne),2014(1):24.

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ProtectiveroleofGingkoBilobaextractinintestinalmucosalbarrierofintestinalinflammationmouse*

ZhaoHongwei1,HeLili2,HanHua3,YueYuehong4,KangWei5,ZhuYeshan6,LiuJianping7△

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofGerontology;3.DepartmentofGynecology;4DepartmentofNeurology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;5.DepartmentofGastroenterology,XinleMunicipalHospital,Xinle,Hebei050700，China;6.DepartmentofSpleenandStomach,TangshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tangshan,Hebei063000,China;7.DepartmentofSpleenandStomach,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine;Shijiazhuang,Hebei050071,China)

ObjectiveTo investigate the protective role of Gingko Biloba extract (EGB 761) in intestinal mucosal barrier of intestinal inflammation model mouse.MethodsThirty mice were randomly divided into the control group,model group and EGB 761 group;the animal model was established;the general condition,body mass change,fecal occult blood and colon histopathological changes were observed,the expressions of occludin-1 proteins in colon tissue were detected by immunofluorescence.ResultsThe body mass in the model group appeared to decrease,drinking water and eating food were significantly decreased compared with that in the control group.However after the EGB 761 intervention,the body mass of the model mice was significantly risen again;little inflammatory cells infiltration could be seen in the EGB 761 group,the inflammatory degree was significantly alleviated compared with the model group.The fluorescence distribution of the claudin-1,occludin and zo-1 in colonic tissues of the model group was more disperse compared with the normal group,the fluorescence intensity was weakened with rough edge;after EGB 761 intervention,the fluorescence in the EGB7 61 group was distributed along with the cellular membrane,the intensity was slightly weakened compared with the normal control group,but was still stronger than that in the model group.ConclusionEGB 761 can improve the inflammatory reaction in mouse colonic tissue,its mechanism may be related with its strengthening the protective effect of intestinal mucosal barrier.

EGB 761;ulcerative colitis;acute stage animal model;intestinal mucosal barrier

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.006

R574.62

A

1671-8348(2017)27-3763-04

2016-11-08

2017-04-10)

河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2016180)。

趙紅偉(1979-),博士，主治醫師，主要從事臨床醫學研究?！?/p>

，E-mail:13603396653@163.com。