丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經干細胞的影響*

景 勝，彭 靜，包曉航，陳 杰，杜智勇，李 洪，黃 河

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037)

丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經干細胞的影響*

景 勝，彭 靜，包曉航，陳 杰，杜智勇，李 洪，黃 河△

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037)

目的觀察丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經干細胞的影響。方法將健康同窩日齡7 d(P7)的C57小鼠分為3組：高劑量丙泊酚組、低劑量丙泊酚組和10%脂肪乳對照組。所有小鼠P7接受藥物處理。高劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg；低劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚30 mg/kg；對照組腹腔注射同等體積的10%脂肪乳。部分小鼠注藥24 h(P8)后處死，其余小鼠飼養(yǎng)至日齡14 d(P14)處死。采用免疫組織化學法檢測海馬齒狀回中Ki67、巢蛋白(Nestin)、腦脂結合蛋白(BLBP)及神經元核心抗原(NeuN)的形態(tài)及表達量。結果高劑量丙泊酚組P8小鼠海馬齒狀回中Ki67標記的神經干細胞數(shù)量較10%脂肪乳對照組明顯減少(P<0.01)，且Nestin及BLBP標記的干細胞纖維數(shù)量、長度均受損(P<0.05)。P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽性細胞數(shù)量低劑量丙泊酚組與10%脂肪乳對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組較10%脂肪乳對照組顯著減少(P<0.01)。結論高劑量丙泊酚可抑制海馬齒狀回神經干細胞的增殖，損傷神經干細胞突起數(shù)量及突起形態(tài)，導致神經元成熟障礙。

二異丙酚；干細胞；海馬

丙泊酚因其誘導起效快、蘇醒迅速且無蓄積、不良反應小等優(yōu)點，在臨床兒科及產科麻醉中已逐漸推廣使用。然而，越來越多的臨床觀察表明嬰幼兒術后認知功能改變與全身麻醉藥物接觸有密切關系。近期有研究證實全身麻醉藥物對發(fā)育機體認知功能有潛在的毒性作用，然而其具體作用機制還未明確。文獻報道海馬齒狀回發(fā)育與機體認知功能緊密相關，而海馬齒狀回內干細胞神經發(fā)生決定齒狀回發(fā)育，全身麻醉藥物丙泊酚是否通過調控海馬齒狀回干細胞進而影響機體認知功能尚不清楚。本研究擬采用丙泊酚處理發(fā)育小鼠模型，通過免疫組織化學及免疫熒光檢測丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回干細胞的影響，探討丙泊酚影響發(fā)育小鼠術后認知功能的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 丙泊酚購自Astra Zenenca公司，10%脂肪乳購自Fresenius Kabi公司，兔抗Ki67購自Thermo公司，鼠抗巢蛋白(Nestin)購自BD公司 ，兔抗腦脂結合蛋白(BLBP)及神經元核心抗原(NeuN)均購自Milliproe 公司。生物素化抗鼠、抗兔二抗購自Invitrogen公司，顯色試劑盒DAB購自北京中杉公司，熒光二抗cy3抗兔、488抗鼠購自Jackson公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物與分組 本研究動物實驗經第三軍醫(yī)大學動物倫理委員會同意，所有動物實驗步驟均遵照美國國家衛(wèi)生局動物實驗準則(2011版)進行，研究所需的健康C57BL/6J臨產孕鼠由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，小鼠自由充足攝取食物和水，正常晝夜更替，飼養(yǎng)室溫控制在23 ℃左右。小鼠出生當日記為P0，將日齡7 d(P7)同窩小鼠按照隨機數(shù)字表分為3組：高劑量丙泊酚組、低劑量丙泊酚注射組、10%脂肪乳對照組。

1.2.2藥物處理 按照本課題組之前研究[1]制備發(fā)育小鼠麻醉暴露模型。腹腔注射不同劑量丙泊酚或10%脂肪乳。高劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg，低劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚30 mg/kg，10%脂肪乳對照組腹腔注射等體積10%脂肪乳。注射藥物后將小鼠置于37 ℃恒溫充氧保溫箱中，待小鼠麻醉蘇醒后放回母鼠籠。注藥24 h后(P8)處死部分小鼠獲取大腦標本，其余小鼠飼養(yǎng)至14 d(P14)處死獲取大腦標本。

1.2.3免疫組織化學 P8小鼠通過拖頸處死；P14小鼠以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,經左心室灌注0.9%生理鹽水約50 mL后，繼續(xù)灌注預冷的4%多聚甲醛約100 mL，灌注完畢后斷頭，收集大腦標本用新鮮的4%多聚甲醛固定24 h,隨后采用30%蔗糖溶液脫水，待其充分脫水后，OCT包埋后用萊卡冰凍機切片(40 μm)，并將其置于凍存液中-20 ℃保存。選取合適的片源用0.01 mol/L PBS漂洗后，3%H2O2室溫處理20 min，0.01%PBS漂洗后浸泡于0.3%Triton X-100中，置于37 ℃孵箱孵育30 min，3%BSA封閉反應1 h。分別加入含有一抗工作液兔抗Ki67(1∶500)及BLBP(1∶500)、鼠抗Nestin(1∶200)及NeuN(1∶500)，4 ℃孵育過夜。0.01%PBS漂洗后BLBP加入辣根過氧化物酶標記的488驢抗鼠IgG(1∶200)；Nestin加入辣根過氧化物酶標記的Cy3驢抗兔IgG(1∶200)；Ki67加入生物素化抗兔二抗(1∶500)；NeuN加入生物素化抗鼠二抗(1∶500)，均在37 ℃孵育2 h。BLBP、Nestin用PBS漂洗后與DAPI室溫下反應1 min，漂洗后轉移到載玻片上，避光晾干，滴加防淬滅劑后封片。Ki67、NeuN在PBS漂洗后在37 ℃與SABC反應1 h，DAB顯示，貼片晾干，中性樹脂封片。

2 結 果

2.1高劑量丙泊酚抑制P8小鼠海馬齒狀回內神經干細胞的增殖 采用細胞增殖相關的核抗原標記物Ki67檢測丙泊酚對P8小鼠海馬齒狀回中神經干細胞的影響(圖1A～F)。免疫組織化學結果顯示，Ki67標記的具有增殖功能的神經干細胞主要分布于海馬齒狀回中的顆粒細胞層。3組Ki67陽性細胞形態(tài)上未見明顯差異，高劑量丙泊酚組齒狀回顆粒細胞層的Ki67陽性細胞數(shù)量較低劑量丙泊酚組、10%脂肪乳對照組減少且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1G。低劑量丙泊酚處理組與10%脂肪乳對照組間Ki67陽性細胞數(shù)量未見差異(P>0.05)。

2.2丙泊酚抑制P8小鼠后海馬齒狀回內神經干細胞的數(shù)量且損傷神經干細胞突起 Nestin是一種中間絲類型的蛋白，是神經干細胞的特征性標記物，同時能標記放射狀膠質細胞的突起。通過免疫熒光檢測Nestin評估丙泊酚對P8小鼠海馬齒狀回中神經干細胞的影響(圖2A～F)。研究結果表明：高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中Nestin陽性細胞數(shù)量較10%脂肪乳對照組和低劑量丙泊酚組顯著減少(P<0.01)，見圖2G，同時發(fā)現(xiàn)高劑量丙泊酚組Nestin陽性細胞突起出現(xiàn)受損。

2.3丙泊酚對P8小鼠海馬齒狀回內放射狀膠質細胞的影響 采用放射狀膠質細胞突起的特異性標記物BLBP檢測丙泊酚對P8小鼠海馬齒狀回中神經干細胞形態(tài)的影響(圖3A～F)。免疫熒光結果顯示：高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中BLBP陽性細胞數(shù)量較10%脂肪乳對照組和低劑量丙泊酚組顯著減少(P<0.01)，見圖3G，且放射狀膠質細胞的長突起受損較明顯；而與10%脂肪乳對照組相比較，低劑量丙泊酚處理組僅觀察到海馬齒狀回中BLBP陽性細胞放射狀膠質細胞的長突起受損。

**：P<0.01，與對照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對照組比較

2.4高劑量丙泊酚抑制P14小鼠海馬齒狀回內成熟神經元的數(shù)量 NeuN能夠特異性標記成熟神經元。通過評估P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽性細胞表達量檢測丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回內神經元成熟的影響(圖4A～F)。免疫組織化學結果發(fā)現(xiàn)高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中NeuN陽性細胞數(shù)量較10%脂肪乳對照組顯著減少(P<0.01)，見圖4G，其余未見明顯差異。

3 討 論

越來越多的動物實驗表明在腦發(fā)育關鍵時期接觸全身麻醉藥物會對大腦產生潛在毒性，并可能損傷機體遠期的認知功能。最近臨床回顧性研究表明小于3歲嬰幼兒單次接觸全身麻醉藥物可能會導致學習、記憶和抽象推理障礙，且小于2歲嬰幼兒接觸兩次或多種麻醉藥物在19歲之前診斷注意力缺陷運動障礙風險是健康人的2倍[1-2]。既往研究表明嬰幼兒術后學習、記憶、認知能力障礙發(fā)生發(fā)展與全身麻醉藥物暴露有一定關聯(lián)[3]。

丙泊酚因麻醉誘導起效快、蘇醒迅速且無蓄積、不良反應少等優(yōu)點，已成為臨床產科和兒科手術麻醉最常用全身麻醉藥物之一。既往研究證實丙泊酚通過GABA受體影響腦內細胞凋亡或腦內神經遞質改變[4-7]。同時有研究表明嬰幼兒使用全身麻醉藥物與認知功能改變之間沒有因果關系[8]。而Stargatt等[9]的隊列研究指出丙泊酚是引起嬰幼兒行為改變的重要危險因素之一；Wilder等[3]研究表明嬰幼兒期使用丙泊酚能導致后期學習障礙。況且，眾所周知與丙泊酚作用機制相似的乙醇在孕期或嬰幼兒期使用會導致嬰幼兒行為異常和認知障礙。

全身麻醉藥物引起認知功能障礙主要表現(xiàn)為海馬主宰的空間定向力受損、學習和記憶力受損，但其發(fā)生機制尚未明確。研究表明，決定海馬功能的重要因素取決于海馬顆粒下區(qū)齒狀回中神經干細胞產生發(fā)育成熟神經元的能力[10-11]。出生后早期海馬齒狀回神經干細胞為放射狀膠質細胞(radial glial cells,RGCs)，與大腦皮質內的RGCs類似，海馬齒狀回內的RGCs為具有極性特征的雙極細胞，其放射狀長突起起到了類似于“腳手架”的作用，從而引導海馬齒狀回內神經干細胞的遷移、分化[12]。海馬齒狀回中RGCs的神經發(fā)生是形成新學習記憶的基礎。Barry等[13]證實RGCs在神經發(fā)生在大腦功能的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。出生后海馬神經發(fā)生可以被環(huán)境因素和神經遞質改變調控[14-15]。因此，丙泊酚是否通過調控海馬神經干細胞神經發(fā)生從而影響機體后期認知功能值得研究。

Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，是目前用來判斷細胞增殖能力的主要指標之一。本研究免疫組織化學結果表明高劑量60 mg/kg丙泊酚組較10%脂肪乳對照組海馬齒狀回的Ki67陽性細胞明顯減少，低劑量30 mg/kg丙泊酚組與10%脂肪乳對照組無明顯差異，提示丙泊酚抑制發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經干細胞增殖且呈劑量依賴性。新生期海馬齒回神經干細胞作為海馬神經發(fā)生的起始點，其數(shù)量減少必將對海馬的正常發(fā)育過程造成影響，這可能導致更遠期的神經功能改變。

Nestin是神經干細胞特征性標記物，同時可以標記RGCs的突起[16]。筆者發(fā)現(xiàn)相對于10%脂肪乳對照組，高劑量60 mg/kg丙泊酚不僅減少RGCs的突起數(shù)量，還導致長突起的形成障礙。這個結論筆者又通過主要表達于RGCs，功能涉及神經元的發(fā)育的BLBP指標進行驗證，免疫熒光BLBP研究結論和Nestin熒光研究結果趨勢一致。這提示丙泊酚不僅影響發(fā)育小鼠齒狀回中干細胞增殖能力，還能夠抑制RGCS的發(fā)生。RGCS在海馬的神經發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用，一方面其能夠提供“腳手架”引導海馬中神經元的遷移，形成正常海馬的分層結構；另一方面，RGCS作為神經祖細胞的一種，可以進一步分化成為神經元及神經膠質細胞，是海馬中神經元及膠質細胞的來源。RGCs的發(fā)育受阻，對于海馬正常結構形成及功能都有一定的影響。

通過檢測成熟神經元標記物NeuN觀察海馬區(qū)域成熟神經元數(shù)量，發(fā)現(xiàn)高劑量60 mg/kg丙泊酚組P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽性細胞數(shù)明顯減少且與10%脂肪乳對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而低劑量30 mg/kg丙泊酚組與10%脂肪乳對照組比較NeuN陽性細胞數(shù)未見明顯差異,提示高劑量丙泊酚抑制小鼠海馬齒狀回神經干細胞發(fā)育成熟，并最終導致神經元數(shù)量減少。海馬中神經元是海馬發(fā)揮正常功能的基礎，這提示結構的改變及神經元數(shù)量的減少是丙泊酚暴露引起的行為改變的關鍵因素。

綜上所述，本研究結果表明丙泊酚抑制發(fā)育小鼠海馬齒狀回中神經干細胞的增殖，同時損傷干細胞突起數(shù)量和形態(tài)，最后導致成熟神經元的減少。丙泊酚影響發(fā)育小鼠海馬齒狀回干細胞的毒性作用呈現(xiàn)劑量依賴性。筆者合理推測高劑量丙泊酚會影響海馬齒狀回神經發(fā)生，通過此機制也能解釋臨床觀察發(fā)現(xiàn)嬰幼兒接觸全身麻醉藥物丙泊酚后出現(xiàn)認知功能改變，但是其如何具體參與到臨床行為學的改變，有待后期更深入的研究。

[1]Huang J,Jing S,Chen X,et al.Propofol administration during early postnatal life suppresses hippocampal neurogenesis[J].Mol Neurobiol,2016,53(2):1031-1044.

[2]Olsen EA,Brambrink AM.Anesthesia for the young child undergoing ambulatory procedures:current concerns regarding harm to the developing brain[J].Curr Opin Anaesthesiol,2013,26(6):677-684.

[3]Wilder RT，F(xiàn)lick RP,Sprung J,et al.Early exposure to anesthesia and learning disabilities in a population-based birth cohort[J].Anesthesiology,2009，110(4):796-804.

[4]Yu D，Jiang Y,Gao J,et al.Repeated exposure to propofol potentiates neuroapoptosis and long-term behavioral deficits in neonatal rats[J].Neuroscience Letters,2013，534(1):41-46.

[5]Creeley C,Dikranian K,Dissen G,et al.Propofol-induced apoptosis of neurones and oligodendrocytes in fetal and neonatal rhesus macaque brain[J].Br J Anaesth,2013，110 Suppl 1:29-38.

[6]Luo Y,Coskun V,Liang A,et al.Single-cell transcriptome analyses reveal signals to activate dormant neural stem cells[J].Cell,2015,161(5):1175-1186.

[7]Ponten E,Fredriksson A,Gordh T,et al.Neonatal exposure to propofol affects BDNF but not CaMKⅡ,GAP-43,synaptophysin and tau in the neonatal brain and causes an altered behavioural response to diazepam in the adult mouse brain[J].Behav Brain Res,2011,223(1):75-80.

[8]Geil CR,Hayes DM,McClain JA,et al.Alcohol and adult hippocampal neurogenesis:promiscuous drug,wanton effects[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2014(54):103-113.

[9]StargattR,DavidsonAJ,HuangGH,etal.AcohortstudyoftheincidenceandriskfactorsfornegativebehaviorchangesinchildrenaftergeneralanesthesiaCurrent state of anti-PD-L1 and anti-PD-1 agents in cancer therapy[J].Mol Immunol,2015,67(2):4-17.

[2]趙飛龍，麥海星，李學超，等．PD-1/PD-L1信號通路在免疫細胞中的作用及其阻斷抗體在腫瘤治療中的應用[J]．細胞與分子免疫學雜志，2015(5)：701-703．

[3]Gibson A,Ogese M,Sullivan A,et al.Negative regulation by PD-L1 during drug-specific priming of IL-22-secreting T cells and the influence of PD-1 on effector T cell function[J].J Immunol,2014,192(6):2611-2621.

[4]Brahmer JR,Tykodi SS,Chow LQ,et al.Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer[J].N Engl J Med,2012,366(26):2455-2465.

[5]Bouchard MJ,Schneider RJ.The enigmatic X gene of hepatitis B virus[J].J Virol,2004,78(23):12725-12734.

[6]Tang H,Oishi N,Kaneko S,et al.Molecular functions and biological roles of hepatitis B virus x protein[J].Cancer Sci,2006,97(10):977-983.

[7]Guo L,Wang X,Ren L,et al．HBx affects CUL4-DDB1 function in both positive and negative manners[J]．Biochem Biophys Res Commun ，2014，450(4):1492-1497.

[8]Feitelson MA,Duan LX.Hepatitis B virus X antigen in the pathogenesis of chronic infections and the development of hepatocellular carcinoma[J]．Am J Pathol,1997(150):1141-1157.

[9]Li T,Robert EI,van Breugel PC,et al．A promiscuous alpha-helical motif anchors viral hijackers and substrate receptors to the CUL4-DDB1 ubiquitin ligase machinery[J].Nat Struct Mol Biol 2010,17(2):105-111.

[10]Angers S,Li T,Yi X,et al．Molecular architecture and assembly of the DDB1-CUL4A ubiquitin ligase machinery[J]．Nature,2006，443(7111):590-593.

[11]Carreno BM,Collins M.The B7 family of ligands and its receptors:new pathways for costimulation and inhibition immune responses[J].Annu Rev Immunol,2002,20(1):29-53.

[12]Belloni L,Allweiss L,Guerrieri F,et al．IFN-alpha inhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanized mice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNA minichromosome[J].J Clin Inves，2012(122)：529-537.

Effectsofpropofolonneuralstemcellsinmousedevelopinghippocampaldentategyrus*

JingSheng,PengJing,BaoXiaohang,ChenJie,DuZhiyong,LiHong,HuangHe△

(DepartmentofAnesthesiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

ObjectiveTo observe the effects of propofol on neural stem cells in mouse developing hippocampal dentate gyrus (DG).MethodsHealthy 7 d old mice from the same litters were randomly allocated into three groups:high dose propofol group,low dose propofol group and 10% fat emulsion control group.All mice were treated with drugs on postnatal 7 d.The mice in high dose propofol group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg propofol;the mice in low dose group were intraperitoneally injected 30 mg/kg propofol;while the mice in the control group with equivalent volume of 10% fat emulsion.Some mice were sacrificed at 24 h after medication injection,and the others were sacrificed at postnatal 14 d.The morphology and expression levels of Ki67,Nestin,BLBP and NeuN in hippocampal DG were detected by immunohistochemical method.ResultsHealthy 7 d old mice from the same litters were randomly allocated into three groups:high dose propofol group,low dose propofol group and 10% fat emulsion control group.All mice were treated with drugs on postnatal 7 d.The mice in high dose propofol group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg propofol;the mice in low dose group were intraperitoneally injected 30 mg/kg propofol;while the mice in the control group with equivalent volume of 10% fat emulsion.Some mice were sacrificed at 24 h after medication injection,and the others were sacrificed at postnatal 14 d.The morphology and expression levels of Ki67,Nestin,BLBP and NeuN in hippocampal DG were detected by immunohistochemical method.ConclusionHigh dose propofol inhibits the proliferation of neural stem cells in hippocampal DG,and impaired the prominence number of neural stem cells and causes neurons dysmaturity.

propofol;stem cells;hippocampus

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.005

R994.1

A

1671-8348(2017)27-3759-04

2016-11-28

2017-05-06)

國家自然科學基金資助項目(81370210)。

景勝(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事麻醉藥物毒性研究。△

，E-mail:13708385559@163.com。