N-乙酰-L-色氨酸對大鼠肝臟缺血再灌注后腸損傷的保護作用*

王淑惠，姜紅心，李曉雙，胡夢琪，于 海，張 明，于樹娜，王健欣，蔣吉英△

(1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院2013級17班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學院人體解剖學教研室,山東濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院2013級7班,山東濰坊 261053)

N-乙酰-L-色氨酸對大鼠肝臟缺血再灌注后腸損傷的保護作用*

王淑惠1，姜紅心2，李曉雙2，胡夢琪3，于 海2，張 明2，于樹娜2，王健欣2，蔣吉英2△

(1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院2013級17班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學院人體解剖學教研室,山東濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院2013級7班,山東濰坊 261053)

目的探討N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)對大鼠肝臟缺血再灌注中腸損傷的保護作用。方法將健康成年雄性SD大鼠24只分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)和缺血再灌注加L-NAT組(IR+L-NAT組)。用夾閉肝中葉和左葉肝蒂分支的方法制作肝缺血再灌注模型，用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察小腸組織的形態(tài)學結構,用免疫組織化學染色觀察激活型Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達。結果(1)IR組小腸絨毛結構破壞，腸黏膜充血脫落,上皮細胞變性壞死，出現(xiàn)炎癥細胞浸潤；L-NAT可使之減輕。(2)免疫組織化學染色顯示，與Sham組相比，IR組激活型Caspase-3、Bcl-2和bax的表達升高，L-NAT干預后，Caspase-3和Bax的表達下降，而Bcl-2的表達進一步升高。結論L-NAT可抑制肝臟缺血再灌注損傷引起的小腸上皮細胞凋亡，減輕小腸上皮細胞損傷。

缺血再灌注損傷;小腸;N-乙酰-L-色氨酸;細胞凋亡;大鼠

在近代肝臟外科手術中，腸道損傷是常見的病理生理現(xiàn)象,手術中肝門阻斷可造成門靜脈淤血致腸黏膜屏障破壞,腸黏膜通透性增高,引發(fā)腸內毒素及菌群移位,加重肝臟缺血再灌注損傷，形成惡性循環(huán)[1-2]，從而影響手術的成功率和患者的存活率。有研究發(fā)現(xiàn),P物質(substance P,SP)通過SP/NK-1系統(tǒng)參與了心、腦、肝、胰腺、肺、結腸等多種內臟器官的氧化應激損傷[3-7]。N-乙酰-L-色氨酸(N-acetyl-L-tryptophan,L-NAT)具有拮抗NK-1受體的作用[8],但對肝臟缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)后小腸上皮細胞損傷的保護作用尚未見報道。本研究通過建立肝臟IR模型,探討L-NAT對腸損傷的保護作用，為開發(fā)治療肝臟IR后腸損傷的新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物的分組、動物模型的制備和藥物預處理 健康成年雄性SD大鼠24只，購自山東魯抗制藥有限公司，體質量200～250 g。分為假手術組(Sham組)、IR組、IR加L-NAT組(IR+L-NAT組)，每組8只。實驗動物術前禁食12 h，自由飲水。用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，上腹部正中切口，游離肝門血管，無創(chuàng)血管夾夾至肝左葉、中葉肝蒂的分支30 min，夾閉后肝的顏色由紅色變?yōu)榘底霞t色，表明模型制作成功。在30 min后去除血管夾復流形成再灌注，逐層關腹。6 h后開腹取小腸中段組織。IR+L-NAT組在制備IR模型前30 min腹腔注射10 mg/kg L-NAT，其他處理同IR組。Sham組僅行麻醉開腹分離至左葉、中葉的入肝管道，但不阻斷肝血流。

1.2取材與切片 取部分大鼠小腸組織，生理鹽水沖洗腸糞便物，組織置于多聚甲醛(4 g/L)固定，48 h后梯度濃度蔗糖沉底過夜，冰凍切片(厚10 mm),常規(guī)染色。

A～C:(×200)；D～F:(×400)

圖1小腸上皮細胞的形態(tài)變化(HE染色)

A～C:Bcl-2;D～F:Bax;G～I:Caspase-3

圖2免疫組織化學染色顯示Bcl-2、Bax和Caspase-3在小腸上皮細胞中的表達(×400)

1.3HE染色 常規(guī)冰凍切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察小腸絨毛和上皮細胞的變化。

1.4免疫組織化學染色 采用SP法進行Caspase-3(Cell Signaling，1∶200)、Bcl-2(Santa Cruz,1∶200)、Bax(Santa Cruz,1∶200)免疫組織化學染色，以PBS代替一抗做陰性對照。

2 結 果

2.1小腸光鏡病理觀察 HE染色顯示，Sham組腸絨毛完整，排列整齊,隱窩結構明顯。IR組腸絨毛結構破壞嚴重，絨毛頂部大量脫落破裂,潰瘍嚴重，上皮細胞變性壞死，大量炎性細胞浸潤，腸壁各層出現(xiàn)出血，隱窩結構破壞。IR+L-NAT組形態(tài)變化明顯減輕，小腸絨毛基本完整，小腸絨毛上皮細胞輕度水腫，有少量炎性細胞浸潤(圖1)。

2.2免疫組織化學Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達 免疫組織化學染色顯示，免疫組織化學陽性信號可不同程度表達于小腸黏膜上皮細胞中，呈棕黃色或黃褐色顆粒，其中，Bax在細胞質表達，Bcl-2在細胞質和細胞膜表達，Caspase-3在細胞核表達。Bax、Bcl-2和Caspase-3在Sham組均無表達。IR組Caspase-3、Bax、Bcl-2等陽性細胞數(shù)量均明顯增多。與IR組比較，L-NAT干預后Caspase-3與Bax的表達減弱，Bcl-2表達增加(圖2)。

3 討 論

肝臟是人體最大的實質性器官，血供比較豐富。在肝臟移植、處理嚴重肝創(chuàng)傷等手術時，為減少術中出血，經(jīng)常需要阻斷肝門，而重新恢復血液供應則可造成肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)[9]。近年來有研究表明，肝臟缺血缺氧使大量Ca2+進入細胞內造成鈣超載，促使黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，為氧自由基的產生提供催化劑。肝臟缺血缺氧時，肝細胞的無氧酵解，會使酸性代謝產物堆積過多，pH值降低，而灌注后pH值的改變，則會促進細胞死亡，加重缺血再灌注損傷(IRI)；同時，肝臟中的kupffer細胞被激活并釋放大量毒性介質，干擾DNA的逆轉錄過程，使細胞內具有酶活性的蛋白質失活，細胞發(fā)生嚴重的功能代謝紊亂，導致肝臟發(fā)生嚴重損傷[10-11]。另有研究表明，肝臟IR不僅影響肝臟結構和生理功能，還參與多種遠隔器官的缺血/缺氧損傷[12]。張東江等[13]發(fā)現(xiàn)，隨HIRI發(fā)生時間延長，腎小球、腎小管細胞發(fā)生水腫壞死，出現(xiàn)嚴重腎功能不全表現(xiàn)。趙磊等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)生HIRI后肺泡腔完整性被破壞，間隔明顯增厚，肺泡上皮細胞變性壞死，并伴有肺水腫。楊進城等[15]發(fā)現(xiàn)肝臟IR后，腎臟、胰腺、心臟中測得SOD活性下降及MDA水平升高，提示HIRI可誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)[16]。

當肝門被阻斷后，門靜脈的反流與入肝血量明顯減少，在加重肝臟缺血的同時，不可避免的造成了腸道的淤血損傷，出現(xiàn)小腸黏膜屏障破壞，腸黏膜通透性增高，造成細菌移位，形成內毒素和菌血癥[17]。當重新恢復血流后，內毒素隨血液回流入肝臟，進而加重HIRI。肝門阻斷后門脈回流受阻導致腸道淤血損傷，當肝臟再灌注時毒性物質又可經(jīng)血液流經(jīng)腸道，導致腸道的雙重損害[18]。因此，腸道被譽為是外科手術的“中心器官”。有學者發(fā)現(xiàn)，肝門阻斷后小腸會出現(xiàn)淤血性損傷[19]。周京安等[20]發(fā)現(xiàn)由于小腸絨毛發(fā)卡式結構的存在，其頂部黏膜層細胞易出現(xiàn)脫落壞死、線粒體腫脹和細胞連接松弛。趙佐慶等[21]發(fā)現(xiàn)犬小腸在IR后腸黏膜淋巴細胞、中性粒細胞等炎性細胞數(shù)量增多，同時Bax、c-Fos基因表達增多，提示小腸IRI與細胞凋亡密切相關。綜上所述，在肝臟缺血手術中保持腸黏膜完整性，減少腸道的損傷具有重要的意義。

細胞凋亡是IR中細胞死亡的重要方式，而線粒體途徑是凋亡的主要途徑。Bcl-2家族和Caspase家族在線粒體途徑中有極為重要的調控作用。Caspase-3在促進細胞凋亡中起關鍵作用，是內源性細胞凋亡和外源性細胞凋亡共同的效應分子，可啟動細胞凋亡，從而形成Caspases依賴性的細胞凋亡[22]。Bcl-2家族中Bax、Bcl-2是目前已知的與細胞凋亡密切相關的功能相對立的基因。研究表明，抗凋亡基因Bax和促凋亡基因Bcl-2的比例可影響細胞凋亡的狀態(tài),即當Bcl-2與Bax比值增高時，促進細胞存活，否則促進細胞凋亡[23]。Bcl-2、Bax作為上游調控基因可改變線粒體膜的通透性，控制下游Caspase-3蛋白酶的活性和Cyt-c的釋放。線粒體釋放的Cyt-c與Apaf-1、dATP結合形成凋亡體，并招募pro-Caspase-9使其激活為活性Caspase-9，后者又可激活Caspase-3，促進細胞凋亡[24-27]。由此可見，在細胞程序性死亡中，Cyt-c發(fā)揮最后通路的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，IR+L-NAT組Caspase-3與Bax表達減弱，Bcl-2表達增強，Caspase-3的表達降低。說明L-NAT可以通過抑制Cyt-c從線粒體向胞質中釋放，減少活化型Caspase-3的表達，從而減少細胞的凋亡。

研究表明，P物質是一個由11個氨基酸組成的多肽，它作為一種興奮性胃腸激肽大量分布在腸道的肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢。P物質通過與NK-1受體結合，刺激腸黏膜分泌水和電解質，加快離子轉運，導致腸管擴張，通透性增加，同時誘導細胞表達TNF-α和分泌TNF-α調節(jié)炎性細胞因子[3]。朱金照等[26]發(fā)現(xiàn)，肝衰竭時小腸的功能減弱與P物質的分布有一定的關系。L-NAT是P物質特異性受體NK-1的拮抗劑，是由美國FDA批準的用于治療惡心、嘔吐和精神病變的藥物。有學者已證實L-NAT對新生鼠腦缺血缺氧具有保護作用[27-28]，但對肝臟缺血后腸損傷的保護作用未見報道。本研究通過肝門阻斷法完全阻斷肝臟血流，制備肝臟IR模型。研究發(fā)現(xiàn)Sham組腸絨毛完整，排列整齊。IR組腸絨毛結構破壞嚴重，頂部絨毛大量脫落破裂,上皮細胞變性壞死，大量炎性細胞浸潤。而IR+L-NAT組形態(tài)變化明顯減輕，小腸絨毛基本完整，較IR組有較大改善。因此可以說明L-NAT對肝臟缺血后腸損傷具有保護作用。

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ProtectiveeffectofN-acetyl-L-tryptophanonintestinaldamageafterrathepaticischemiareperfusion*

WangShuhui1,JiangHongxin2,LiXiaoshuang2,HuMengqi3,YuHai2,ZhangMing2,YuShuna2,WangJianxin2,JiangJiying2△

(1.Class17ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;2.TeachingandResearchingSectionofAnatomy，WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;3.Class7ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261053,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of N-acetyl-L-tryptophan (L-NAT) on intestinal damage after rat hepatic ischemia reperfusion.MethodsTwenty-four healthy adult rats were divided into the sham operation group (Sham),ischemia reperfusion group (IR),ischemia reperfusion and N-acetyl-L-tryptophan group(IR+L-NAT).The hepatic ischemia reperfusion model was established by occluding the afferent vessels of the left and middle lobes.The morphological structures of the small intestine were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The expressions of active caspase-3,Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry staining.Results(1) In the IR group,the structure of intestinal villis was destroyed,the intestinal mucosa showed congestion and exfoliation,the epithelial cells had degeneration and necrosis,and infiltration of inflammatory cells appeared;which could be alleviated by L-NAT.(2)The immunohistochemistry showed that compared with the Sham group,the expression of active caspase-3,Bcl-2 and Bax in the IR group was increased,after L-NAT intervention,the Bax and caspase-3 expression was decreased,while the Bcl-2 expression was further increased.ConclusionL-NAT could inhibit the apoptosis of small intestinal epithelial cells caused by liver ischemic reperfusion and attenuates intestinal epithelial damage.

ischemia-reperfusion injury;small intestine;N-acetyl-L-tryptophan;apoptosis；rat

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.002

R657.3

A

1671-8348(2017)27-3748-04

2016-11-05

2017-05-21)

山東省自然科學基金資助項目(ZR2010HM006;ZR2014HL020；ZR2014HL021)；山東省教育廳資助課題(J11LF14)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃資助課題(2014WS0464)；濰坊醫(yī)學院科技創(chuàng)新研究基金資助項目(K1301001)；濰坊醫(yī)學院大學生科技創(chuàng)新基金資助項目(KX20150091)；2015年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201510438010;201510438007)。

王淑惠(1994-)，本科,主要從事肝損傷研究。△

，E-mail:jiangjiying2002@163.com。