散發性先天性巨結腸與SOX10基因多態性的關聯性

羅春芬，黎勝苗，潘志文，許嘉川，劉征吉，於林軍

（1.溫州醫科大學附屬臺州醫院 小兒外科，浙江 臺州 317000；2.浙江大學醫學院 細胞生物研究所，浙江 杭州 310058）

散發性先天性巨結腸與SOX10基因多態性的關聯性

羅春芬1，黎勝苗1，潘志文2，許嘉川1，劉征吉1，於林軍1

（1.溫州醫科大學附屬臺州醫院 小兒外科，浙江 臺州 317000；2.浙江大學醫學院 細胞生物研究所，浙江 杭州 310058）

目的：探討先天性巨結腸（HD）患者SOX10基因多態性與HD發病風險的關系。方法：收集散發性HD患者外周血標本95例為病例組，同時選取健康無便秘史患者80例作為對照組。提取外周血DNA，采用PCR和直接測序法分析SOX10基因多態性在病例組和對照組的分布情況。結果：直接測序發現SOX10基因有4個單核苷酸多態性位點（SNP），這些位點在病例組和對照組中分布差異無統計學意義，關聯分析未發現SOX10基因的4個SNP位點與HD的發病風險相關。結論：SOX10基因的4個SNPs位點與散發HD的發病風險沒有顯著相關性，SOX10基因可能不是散發性HD患者的易感基因。

SOX10基因；先天性巨結腸；多態性，單核苷酸

Abstract: Objective:To determine the association between the variations ofSOX10gene and sporadic HD in Zhejiang province.Methods:Blood from 95 sporadic HD cases and 80 normal cases were collected. Direct sequencing and polymerase chain reaction amplification were used to analyze 4 exons of theSOX10gene for mutations and polymorphisms.Results:In this study, 4 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified. NoSOX10gene mutations was found with sporadic HD.Conclusion:There is no association between these 4 SNPs of theSOX10gene and HD. TheSOX10gene may not be the susceptibility gene of HD.

Key words:SOX10gene; hirschsprung disease; polymorphism, single nucleotide

先天性巨結腸（hirschsprung disease，HD）又稱無神經節細胞性巨結腸（aganglionar megacolon）或腸無神經節細胞癥（aganglionosis），是小兒常見的先天性消化道畸形，主要組織病理改變為病變段腸管黏膜下層和肌層神經節細胞缺如，造成該段腸管呈持續性痙攣狀態，導致近端腸管代償性擴張，從而出現便秘、腸梗阻、小腸結腸炎等一系列消化道癥狀，發病率約為1/5 000[1]。其發病與遺傳因素有關，一些與腸神經發育有關的基因突變可導致HD發生。RET基因是主要的易感基因，由RET編碼區突變引起的HD占家族性HD的50%和散發性HD的7%～35%；其他基因如EDNRB、EDN3等也與HD發病相關，是HD的易感基因[2-3]。

SOX10基因位于染色體22q13，編碼466個氨基酸組成的轉錄因子，是調控神經嵴細胞發育的關鍵轉錄因子[4]，主要調節神經嵴源性細胞包括黑色素細胞和腸神經細胞的正常發育[5]。Shah-Waardenburg綜合征（WS4）患者中有SOX10基因雜合突變檢出，患者除了有HD的癥狀，還表現為色素缺陷、耳聾等。迄今已發現有多例綜合征型HD病例中檢測出有攜帶SOX10基因突變[6-10]，但SOX10基因與散發性HD的相關性研究較少。本研究通過對照分析浙江省散發性HD病例和正常人群的SOX10基因多態性，探討SOX10基因是否與散發性HD的發病相關。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣收集：收集2011年至2015年間經溫州醫科大學附屬臺州醫院和浙江大學醫學院附屬兒童醫院臨床和病理確診的95例散發性HD患兒血樣為病例組，其中男71例，女24例，年齡2個月～13歲，漢族，按Rome分型標準[11]分為：短段型36例，常見型28例，長段型24例，全結腸型7例。所有病例直系親屬無HD患者，無其他合并癥。收集同期健康兒童80例血樣為對照組。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患者監護人知情同意。

1.1.2 PCR引物序列：根據SOX10基因的外顯子使用primer5.0軟件設計引物，引物序列見表1。

表1 SOX10基因4個外顯子引物序列

1.2 方法 取病例組和對照組外周血2 mL，根據DNA提取試劑盒說明進行DNA抽提。PCR反應體系：95 ℃預變性5 min，以94 ℃ 1 min，56～62 ℃（第1外顯子56 ℃，第2外顯子62 ℃，第3外顯子58 ℃，第4外顯子56 ℃）30 s，72 ℃ 45 s，循環30次，最后72 ℃延伸10 min。測序之前，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化所有引物，C18柱回收。應用ABI3000自動測序儀進行突變篩查。所有目的基因的測序結果重復3次。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0進行統計分析。采用卡方檢驗檢測對照組基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。運用邏輯回歸方法，在顯性、共顯性、超顯性、隱性、加性五種不同遺傳模式下分析單個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）和HD是否相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

通過PCR擴增目的片段后測序，與基因庫SOX10序列比對，結果在SOX10基因上發現4個SNPs（見圖1）。SNP1在第2外顯子編碼區，基因序列改變為GAC→GAT；SNP2位于第2外顯子編碼區，基因序列改變為GGC→GTC，引起第41位甘氨酸變為纈氨酸；SNP3位于第2內含子區域，基因序列改變為C＞G；SNP4位于第4外顯子編碼區，基因序列改變為CAT→CAC，是第309位組氨酸的同義突變。

在對照組中，4個SNP位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P值分別為0.39、0.96、0.82、0.39）。基因型分布和4個SNP的等位基因頻率在病例組和對照組之間差異均無統計學意義（χ2分別為1.15、0.19、0.38、0.12，P分別為0.28、0.67、0.54、0.73），見表2。

3 討論

HD發病率約為1/5 000，占先天性消化道畸形疾病的第2位，以腸神經嵴細胞遷移障礙導致腸道局部神經節細胞缺失為主要病理特征，臨床上表現為便秘、腸梗阻、小腸結腸炎等消化道癥狀，嚴重影響患兒的生活質量及生長發育，嚴重者甚至危及生命[12]。近年來，HD的發病率呈逐漸上升趨勢，其發病機制已成為研究熱點。目前認為，HD是由遺傳、腸壁內微環境改變、環境等多因素共同作用引起的，而遺傳因素最為重要。RET基因及其配體GDNF、NTN，EDNRB基因及其配體EDN3，BMP信號通路，KBP，L1CAM黏附分子，KIAA1279，轉錄因子PHOX2B、SOX10、MASH1、HAND2和ZFHX1B等在HD發病中起重要作用[13-14]，它們的異常引起信號傳導的異常，從而進一步影響神經嵴細胞的分化、增殖以及移行，最后導致HD的發生[15-16]。近年來，有關SOX10基因的研究逐漸增多，但未發現相關突變熱點，僅對合并有HD相關綜合征如WS4（Shah-Waardenburg syndrome，OMIM 277580）及PCWH（peripheral demyelinating neuropathy，central dysmyelinating leukodystrophy，WS，and HD，OMIM 609136）等患者有較多的報道，而對HD患者的研究鮮有報道[6-10]。

SOX10基因位于染色體22q13，屬于SOX基因家族成員。SOX基因家族編碼一系列SOX家族轉錄因子，主要特征是含有一個高度保守的HMG-box DNA結合域，參與胚胎發育和細胞分化的調控[17-18]。SOX10基因編碼466個氨基酸組成的轉錄因子，參與調節多能神經嵴細胞的基因表達，在神經嵴細胞增殖、遷移、分化及發育等過程中起著非常重要的作用[5，8，19-20]。PINGAULT等[21]在1998年首先報道了WS4患者存在SOX10基因的突變。2010年，SáNCHEZMEJíAS等[10]報道在西班牙HD人群中發現了SOX10缺失（c.153-155del），并且認為在HMG結構域上游的SOX10的缺失在功能上等同于無效突變。本研究選取散發性HD患兒及健康兒童進行病例對照研究，未發現SOX10相關位點的突變與HD發病相關，表明SOX10不是散發性HD患者發病的主要原因。然而，我們在SOX10基因中檢測了4個SNP位點，SNP1檢測結果與SáNCHEZ-MEJíAS等[10]的報道一致，不改變氨基酸編碼序列；SNP2是本研究新發現的SNP位點，使得編碼的氨基酸從甘氨酸變為纈氨酸，突變位點位于SOX10 HMG保守區域上游，且無一例患者具有WS4、PCWH等其他相關臨床表現，此多態性位點在國內尚未見報道，其多態性引起的氨基酸序列對SOX蛋白功能的影響仍不清楚，需要進一步的研究；SNP3是內含子多態性位點；SNP4在SNP數據庫中序號是rSl39884，該位點是一個同義突變點，編碼氨基酸為組氨酸。在4個位點的分析中，盡管正常對照組符合Hardy-Weinberg平衡，但分析顯示4個SNP位點在病例組和對照組中分布無顯著性差異，表明這4個SNP位點與HD的發病不存在相關性。由4個SNP位點組成的單體型在HD病例組和正常組中的分布也未見顯著性差異，這些單體型與HD發病不具有相關性。以上研究結果表明，SOX10基因可能不是HD發病的易感基因。

圖1 SOX10基因測序結果

表2 SOX10基因4個SNP位點在病例組和對照組的頻率分布（%）

[1] GATH R, GOESSLING A, KELLER K M, et al. Analysis of the RET, GDNF, EDN3, and EDNRB genes in patients with intestinal neuronal dysplasia and Hirschsprung disease[J]. Gut, 2001, 48(5): 671-675.

[2] AURICCHIO A, CASARI G, STAINANO A, et al. Endothelin-B receptor mutations in patients with isolated Hirschsprung disease from a non-inbred population[J]. Hum Mol Genet, 1999, 5(3): 351-354.

[3] BIDAUD C, SALOMON R, VAN CAMP G, et al. Endothelin-3 gene mutations inisolated and syndromic Hirschsprung disease[J]. Eur J Hum Genet, 1997, 5(4): 247-251.

[4] 張艷, 金先慶. 先天性無神經節細胞癥的病理學診斷研究進展[J]. 臨床小兒外科雜志, 2 0 1 2, 1 1(3): 2 1 6-2 1 8.

[5] BONDURAND N, SHAM M H. The role of SOX10 during enteric nervous system development[J]. Dev Biol, 2013, 382(1): 330-343.

[6] LIANG F, ZHAO M, FAN L, et al. Identification of a de novo mutation of SOX10 in a Chinese patient with Waardenburg syndrome type IV[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2016, 91: 67-71.

[7] JIANG L, CHEN H, JIANG W, et al. Novel mutations in the SOX10 gene in the first two Chinese cases of type IV Waardenburg syndrome[J]. Biochem Biophys Res Commun,2011, 408(4): 620-624.

[8] LECERF L, KAVO A, RUIZ-FERRER M, et al. An impairment of long distance SOX10 regulatory elements underlies isolated Hirschsprung disease[J]. Hum Mutat, 2014, 35(3):303-307.

[9] PINGAULT V, ENTE D, DASTOT-LE MOAL F, et al. Review and update of mutations causing Waardenburg syndrome[J]. Hum Mutat, 2010, 31(4): 391-406.

[10] SáNCHEZ-MEJíAS A, WATANABE Y, M FERNáNDEZ R,et al. Involvement of SOX10 in the pathogenesis of Hirschsprung disease: report of a truncating mutation in an isolated patient[J]. J Mol Med, 2010, 88(5): 507-514.

[11] ROMEO G, RONCHETTO P, LUO Y, et al. Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET protooncogene in Hischsprung’s disease[J]. Nature, 1994, 367(6461):377-378.

[12] TJADEN N E, TRAINOR P A. The developmental etiology and pathogenesis of Hirschsprung disease[J]. Transl Res,2013, 162 (1): 1-15.

[13] MCKEOWN S J, STAMP L, HAO M M, et a1. Hirschsprung disease: a developm ental disorder of the enteric nervous system[J]. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2013, 2(1): 113-129.

[14] 羅春芬, 於林軍, 劉征吉, 等. E D N R B和E D N-3基因多態性與先天性巨結腸的相關性研究[J]. 溫州醫學院學報, 2 0 1 0,4 0(5): 4 6 2-4 6 8.

[15] BEST K E, GLINIANAIA S V, BYTHELL M, et a1. Hirschsprungs disease in the North of England: prevalence, associated anomalies, and survival[J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2012, 94(6): 477-480.

[16] 甄亞琴, 徐紀榮. 先天性巨結腸的研究進展[J]. 中國當代醫藥, 2 0 1 5, 2 2(3 4): 2 1-2 4.

[17] 李穎, 黃英, 王大佳, 等. S o x 1 0和E D N R B在人胚胎腸神經系統中的表達[J]. 中國醫科大學學報, 2 0 1 4, 4 3(3): 2 4 3-2 4 6.

[18] BOWLES J, SCHEPERS G, KOOPMAN P. Phylogeny of the SOX family of developmental transcription factors based on sequence and structuralindicators[J]. Dev Biol, 2000, 227(2): 239-255.

[19] BRONNER M E, LEDOUARIN N M. Development and evolution of the neural crest: an overview[J]. Dev Biol,2012, 366(1): 2-9.

[20] SHAM M H, LUI V C, CHEN B L, et al. Novel mutations of SOX10 suggest a dominant negative role in Waardenburg-Shah syndrome[J]. J Med Genet, 2001, 38(9): E30.

[21] PINGAULT V, BONDURAND N, KUHLBRODT K, et al.SOX10 mutations in patients with Waardenburg-Hirschsprung disease[J]. Nat Genet, 1998, 18(2): 171-173.

（本文編輯：丁敏嬌）

Association analysis of theSOX10polymorphism and Hirschsprung

LUO Chunfen1, LI Shengmiao1, PANZhiwen2, XU Jiachuan1, LIU Zhengji1, YU Linjun1. 1.Department of Pediatric Surgery, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Taizhou, 317000; 2.Institute of Cell Biology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310058

R726.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.008

2016-12-26

臺州市科技計劃項目（121ky08）。

羅春芬（1962-），女，浙江臺州人，主任醫師。

於林軍，副主任醫師，Email：yulj@enzemed.com。