轉錄因子SOX7對前列腺癌PC-3細胞生物學活性的影響及其機制

鄭斌，吳齊全，周克文，王鋼，任雨，祁洪剛，朱偉智，翁國斌

（寧波市鄞州第二醫院 泌尿外科，浙江 寧波 315100）

轉錄因子SOX7對前列腺癌PC-3細胞生物學活性的影響及其機制

鄭斌，吳齊全，周克文，王鋼，任雨，祁洪剛，朱偉智，翁國斌

（寧波市鄞州第二醫院 泌尿外科，浙江 寧波 315100）

目的：探討轉錄因子SOX7對前列腺癌PC-3細胞增殖、細胞周期、遷移和侵襲能力的影響及其機制。方法：采用脂質體法轉染高表達SOX7重組質粒（pCDNA3.1-SOX7），以轉染空質粒（Vector）作為對照，檢測SOX7對PC-3細胞株增殖、細胞周期、遷移及侵襲的影響，并用Western blot法檢測相關蛋白表達水平。結果：pCDNA3.1-SOX7顯著抑制PC-3細胞增殖能力，并且誘導細胞周期發生G1期阻滯，同時，使Cylcin D1、E表達量明顯下調。此外，pCDNA3.1-SOX7轉染后，PC-3細胞遷移距離顯著減少，穿透基質膠的細胞數量也顯著降低，并且伴隨著間質表型標記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表達減少，上皮標記物E-cadherin蛋白表達增加。結論：SOX7抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖、周期、遷移及侵襲能力，其機制可能與調控這些細胞行為的相關蛋白表達有關。

SOX7；前列腺癌；增殖；遷移；侵襲

Abstract: Objective:To investigate the effects and mechanisms of transcription factor SOX7 on PC-3 cells proliferation, cell cycle, cell migration and invasion.Methods:PC-3 cells were transfected with highexpressed SOX7 recombinant plasmid (pCDNA3.1-SOX7) and further detected the changes of cell proliferation,cell cycle, migration, invasion, and related protein expressions.Results:After transfection with pCDNA3.1-SOX7, significant inhibition effects was shown in the PC-3 cell proliferation and G1/S cell cycle arrest, which were accompanied with decreased expressions of cyclin D1 and E. Furthermore, transfection of pCDNA3.1-SOX7 markedly decreased the cell migration distances and invasion capacity, with a reduction of the mesenchymal markers (MMP-2, MMP-9 and N-cadherin), however, the epithelial marker E-cadherin was increased.Conclusion:SOX7 inhibits PC-3 cell proliferation, cell cycle, migration and invasion through regulation of its related protein expressions.

Key words:SOX7; prostate cancer; proliferation; migration; invasion

前列腺癌為西方男性人群最常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國的發病率與病死率呈逐年上升趨勢[1-2]。臨床上一般采取手術切除和放射療法為主，然而腫瘤復發與轉移問題已成為目前治療的難點。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節。在此過程中，上皮細胞表型轉化為成纖維細胞的間質表型，上皮細胞間緊密連接相關蛋白表達下調，細胞外基質增多，抗凋亡能力增強，從而促進細胞遷移與侵襲[3]。SOX7作為轉錄調控因子SOX家族成員，特異性識別并結合靶基因5’-（A/T）（A/T）CAA（A/T）G-3’序列，影響基因轉錄水平，在調控胚胎發育過程中起重要作用[4]。近年研究表明，SOX7在腫瘤的發生發展過程中扮演重要角色[5-6]。SOX7在不同組織或細胞中具有表達差異性，在食管癌、胃癌以及胰腺癌中呈高表達狀態，而在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和結直腸癌中呈現低表達[7-11]，在HeLa、HL60、S3、Raji、SW480、K562、MOLT-4、A549細胞株中呈不表達或低表達狀態[7]。本課題組前期研究發現，相對于正常前列腺組織，SOX7在前列腺癌組織中呈低表達狀態，并且與Gleason評分密切相關[12]。預實驗結果表明，前列腺癌細胞株PC-3、DU145的SOX7表達量顯著低于前列腺正常細胞株RWPE-1。為進一步研究SOX7對前列腺癌細胞生物學活性的影響及其機制，本研究用攜帶人過表達SOX7基因的重組載體（pCDNA3.1-SOX7）轉染前列腺癌PC-3細胞，觀察SOX7基因對PC-3細胞體外增殖、周期、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人前列腺癌PC-3細胞株購自中國科學院上海細胞研究所。RMPI 1640無血清培養基、胎牛血清均購自美國Gbico公司；細胞周期蛋白E（Cyclin E）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、CDK4、CDK6、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）鼠抗人單克隆抗體以及細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SOX7、波形蛋白（vimentin）、纖維連接蛋白（fibronectin）兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司；羊抗小鼠IgG二抗與羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及分組 PC-3細胞接種于含10%胎牛血清的培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中飽和濕度培養。預實驗結果發現，相對于Control未處理組，空質粒pCDNA3.1組（Vector組）對PC-3細胞SOX7蛋白表達量及細胞生物學活性均無顯著性影響，因此，本研究僅比較pCDNA3.1-SOX7重組質粒組（pCDNA3.1-SOX7組）和空質粒pCDNA3.1組（Vector組）相關指標。

1.3 pCDNA3.1-SOX7質粒轉染 根據GeneBank中SOX7基因的CDS堿基序列（NM_031439），委托上海吉瑪生物科技有限公司合成pCDNA3.1-SOX7重組質粒。待PC-3細胞生長至50%～60%融合度時，按1∶3比例將質粒和脂質體混合液加入無血清培養基中進行轉染，待6 h后更換為含10%胎牛血清的普通培養基。轉染24 h后用于其他實驗。

1.4 MTT增殖實驗 60 mm培養皿中細胞匯合到80%～90%后，胰酶消化，完全培養基重懸細胞，計數并調整濃度至2×104個/mL，將稀釋好的細胞懸液加到5塊96孔板中，每孔100 μL，做5個復孔。在37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），在培養箱中繼續培養4 h后，吸棄上清，加入150 μL DMSO溶液，于490 nm測各孔吸光度值并記錄結果。

1.5 細胞周期檢測 將PC-3細胞以1×105個/mL濃度接種于培養皿中，待細胞融合度達60%左右，脂質體法轉染pCDNA3.1-SOX7質粒，24 h后用胰蛋白酶消化分裝，離心，70%的冰乙醇沉淀后-20 ℃保存24 h，置于流式管中，避光加入400 μL PI/RNase染色液并混勻，30 min后置于流式細胞儀中檢測細胞周期。

1.6 細胞劃痕實驗 將PC-3細胞以2.5×105個/mL濃度接種于6孔板中，待細胞長至融合度大于90%后，用200 μL槍頭小心垂直于6孔板劃一直線，37 ℃PBS清洗2次，24 h后倒置顯微鏡觀察拍照，并計算遷移距離。

1.7 Transwell實驗 PC-3細胞轉染24 h后，消化，無血清培養基調整濃度至4×104個/mL，取200 μL加入鋪有基質膠的Transwell小室上層，下室內加入600 μL含10%胎牛血清的培養基，待培養24 h后，取出上層小室，用消毒棉簽擦除小室背面的基質膠及未穿膜細胞，置于甲醇固定10 min，0.1%結晶紫染色，PBS清洗2次。倒置顯微鏡下拍照，并計算穿膜數量。

1.8 Western blot實驗 待細胞轉染質粒后再培養24 h，37 ℃ PBS清洗2次，RIPA裂解，離心取上清，BCA法測蛋白濃度。電泳后濕轉印至PVDF膜中，5%脫脂奶粉封閉60 min，4 ℃冰箱中孵育一抗過夜，TBST洗滌5次，二抗孵育60 min，顯影曝光。

1.9 統計學處理方法 應用SPSS18.0軟件將數據進行統計學分析。計量資料用 ±s表示，2組樣本均數比較采用t檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SOX7抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖作用 轉染pCDNA3.1-SOX7高表達質粒于PC-3細胞，經Western blot驗證pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后其SOX7蛋白表達水平顯著上調（見圖1）。MTT實驗顯示，轉染48 h后pCDNA3.1-SOX7組顯著抑制了PC-3細胞的增殖能力（見圖2）；流式細胞術檢查發現，pCDNA3.1-SOX7組誘導PC-3細胞發生G1期阻滯（見圖3）；Cyclin D1、E表達量下調，CDK2、4、6表達量無顯著性改變（見表1）。

2.2 SOX7抑制前列腺癌細胞的遷移與侵襲作用劃痕實驗檢測結果發現，轉染pCDNA3.1-SOX7重組質粒24 h后，pCDNA3.1-SOX7組PC-3細胞的遷移距離顯著性低于Vector組（見圖4、表2）；Transwell試驗結果發現，pCDNA3.1-SOX7組穿透基質膠的細胞數量也顯著性低于Vector組（見圖5、表2）；間質表型標記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表達減少，上皮標記物E-cadherin蛋白表達增加（見表1）。

圖1 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后SOX7蛋白表達水平變化

圖2 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞增殖能力變化

3 討論

近年來，關于高遷移率族蛋白結構域SOX家族基因與腫瘤發生發展的關系已成為研究熱點。

已有研究發現，SOX7是wnt/β-catenin通路的負性調控因子，發揮著抑癌基因的作用。ZHAO等[13]發現，轉染SOX7質粒后，細胞增殖受抑制，wnt/β-catenin轉錄水平降低，同時Cyclin D1和c-Myc蛋白表達下調，但轉染缺失HMG-box結構域SOX7突變質粒后，并不能引起上述現象，因此認為，SOX7通過其本身的HMG-box結構域結合β-catenin并抑制其活性，從而下調β-catenin介導的增殖活性，扮演著抑癌基因的作用。此外，在人子宮內膜癌、卵巢癌、肝癌和乳腺癌的研究[8，14-17]中均有類似的報道。

細胞周期變化與細胞周期蛋白改變有關。其中Cyclin D/CDK4和Cyclin E/CDK2復合物促進細胞周期G1/S期的轉換，Cyclin A/CDK2復合物調控G1/S和G2/M期的轉換，而Cyclin B/CDK2復合物調控G2晚期進入有絲分裂期。據報道[18]，SOX7通過調控wnt/β-catenin通路活性，從而控制Cyclin D1和c-myc的表達，調控細胞增殖過程。本研究通過流式細胞術檢測細胞周期，結果發現，SOX7抑制前列腺癌細胞的增殖能力，并且誘導細胞發生G1期阻滯，伴隨著Cyclin D1、E的顯著性下調，而CDK2與CDK4未見明顯改變，由此可見，SOX7抑制的CylcinD1/CDK4、Cyclin E/CDK2復合物水平下調與細胞周期結果一致。因此，我們認為SOX7通過抑制Cyclin D1、E表達量，從而誘導細胞周期發生G1期阻滯，抑制細胞增殖。

圖3 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞周期變化

SOX7抑制前列腺癌的轉移過程可能與抑制腫瘤血管生成及EMT發生有關。有研究報道，在斑馬魚發育過程中，敲除SOX7與SOX18表達導致血管功能缺失[19]。新近研究發現，SOX7聯合SOX17反饋調節于血管內皮生長因子信號，從而調控血管功能[20]。另外，EMT與惡性腫瘤的轉移與侵襲密切相關[21]。CUI等[22]在胃癌的研究中也發現，SOX7水平與細胞浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期均具有相關性，認為SOX7在胃癌轉移與浸潤過程中扮演重要角色。ZHONG等[23]在研究SOX7與前列腺癌患者生存率的相關性時發現，SOX7在血清前列腺特異性抗原水平小于4 ng/mL的前列腺癌患者中有較高的表達量，并且在發生轉移的患者中SOX7表達量顯著性低于未發生轉移的患者，因此認為，SOX7蛋白表達與腫瘤轉移呈負相關。本課題組前期研究也發現了類似的現象。SOX7在前列腺癌組織中呈現低表達狀態，而Gleason＜7的前列腺癌組織表達量大于Gleason≥7，說明SOX7表達量與前列腺癌浸潤程度有關[12]。此外，我們發現高表達SOX7重組質粒轉染后顯著性抑制了細胞遷移與侵襲過程，伴隨著間質表型標記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白的減少和上皮標記物E-cadherin蛋白增加，這也說明SOX7轉染后對于前列腺癌EMT過程具有抑制作用。

綜上所述，SOX7抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖、周期、遷移及侵襲能力，其機制可能與調控這些細胞行為的相關蛋白表達有關。

表1 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞周期相關蛋白和遷移/侵襲相關蛋白表達變化（n=3， ±s）

圖4 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞遷移能力變化（×40）

圖5 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞侵襲能力變化（×100）

表2 pCDNA3.1-SOX7重組質粒轉染后PC-3細胞遷移及侵襲能力的變化（n=3， ±s）

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（本文編輯：丁敏嬌）

Mechanisms and effects of transcription factor SOX7 on the biological activity of the prostate cancer PC- 3 cells

ZHENG Bin, WU Qiquan, ZHOU Kewen, WANG Gang, REN Yu, QI Honggang, ZHU Weizhi, WENGGuobin. Department of Urologic Surgery, Ningbo Yinzhou No.2 Hospital, Ningbo, 315100

R73-37；R737.25

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.011

2016-12-27

鄞州區科技計劃項目；寧波市科技惠民項目（2017C50 058）。

鄭斌（1982-），男，浙江寧波人，主治醫師，碩士。

翁國斌，主任醫師，教授，Email：ddwgb@aliyun.com。