PARP-1蛋白抑制劑降低TNF-α介導的人心肌細胞生長抑制和凋亡

謝月群，王蕾，陳玲瓏，徐穎，楊之濤，盧中秋

（1.溫州醫科大學第三臨床學院 溫州市人民醫院 急診科，浙江 溫州 325000；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 急診科，上海 200025；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 急診醫學中心，浙江 溫州325015）

PARP-1蛋白抑制劑降低TNF-α介導的人心肌細胞生長抑制和凋亡

謝月群1，王蕾1，陳玲瓏1，徐穎1，楊之濤2，盧中秋3

（1.溫州醫科大學第三臨床學院 溫州市人民醫院 急診科，浙江 溫州 325000；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 急診科，上海 200025；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 急診醫學中心，浙江 溫州325015）

目的：研究PARP-1蛋白抑制劑對由腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導的人心肌細胞生長抑制和凋亡的干預作用。方法：MTT比色法檢測TNF-α抑制人心肌細胞HCM細胞株生長的IC50濃度，以及PARP-1蛋白抑制劑干預對HCM細胞生長抑制率的影響；流式細胞術檢測TNF-α和PARP-1蛋白抑制劑對HCM細胞的細胞凋亡比率的影響；RT-PCR和Western blot分析PARP-1蛋白抑制劑干預對PARP-1基因的mRNA和蛋白水平表達影響。結果：TNF-α對HCM細胞具有明顯細胞增殖抑制和細胞凋亡誘導作用，并且上調PARP-1基因mRNA水平，促進PARP-1蛋白裂解（P＜0.05）；PARP-1蛋白抑制劑干預后，TNF-α對HCM細胞的生長抑制和誘導細胞凋亡作用均減弱（P＜0.05），PARP-1基因表達下調（P＜0.05），PARP-1蛋白和其裂解產物與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：通過PARP-1蛋白抑制劑阻斷PARP-1蛋白活性和基因的轉錄水平可以減弱TNF-α對HCM的細胞生長抑制和細胞凋亡誘導作用。

腫瘤壞死因子α；肌細胞，心臟；PARP-1蛋白抑制劑；細胞凋亡

Abstract: Objective:To study the effect of PARP-1 inhibitor (4-Aminonaphthalimide) on the apoptosis of human cardiomyocytes mediated by TNF-α.Methods:MTT assays were used to detect the IC50concentration of TNF-α on human cardiomyocytes cell line HCM, this assays were also performed to analyze the effect of the treatment with IC50concentration of TNF-α combined with different concentration of PARP-1 inhibitor on proliferation of the HCM cells. Flow cytometry was used to monitor the apoptosis of HCM cells treated with different concentrations of TNF-α with or without PARP-1 inhibitors; RT-PCR and Western blot were used to analyze the expression level of PARP-1 in HCM cells after treated with different concentration of TNF-α with or without PARP-1 inhibitor.Results:TNF-α could perform the inhibitory effect of proliferation and induced the apoptosis of HCM cells, TNF-α also induced the degradation of PARP-1 protein and up-regulated expression ofPAPR-1gene in HCM cells (P＜0.05); The inhibit effect of proliferation and the apoptosis rate of HCM cells induced by TNF-α was decreased after the intervention of PARP-1 inhibitors (P＜0.05). The mRNA expression level ofPARP-1gene was down-regulated and the difference between the intervention group and the control group was not significantly in protein level.Conclusion:The effect of cells growth inhibition and apoptosis induced by TNF-α on HCM can be attenuated by blocking the activity of PARP-1 protein and gene transcription.

Key words:tumor necrosis factor-α; myocytes, cardiac; PARP-1 inhibitor; apoptosis

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種關鍵的調節因子參與炎癥反應，除了通過與其受體結合啟動炎癥免疫應答，還可以作為獨立因素參與心肌損傷[1]。在心臟組織中多種損傷和炎癥均可促進心肌細胞產生TNF-α，如心肌梗死、缺血再灌注和慢性心衰等[2-3]。聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]催化將NAD+中的多聚ADP核糖轉移至DNA或蛋白受體中，這種翻譯后修飾參與了包括DNA損傷修復、DNA復制和基因表達調控等多種細胞過程[4-6]。有研究[7]證實PARP的過度活化可能導致細胞內存儲的NAD+衰竭，從而誘導細胞死亡。因此，本研究通過體外實驗研究PARP-1蛋白抑制劑干預TNF-α對人心肌細胞的生長抑制和細胞凋亡的誘導作用，為進一步探討TNF-α誘導心肌細胞凋亡的機制和信號途徑奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 人心肌細胞HCM細胞株購于南京凱基生物科技有限公司；重組TNF-α購于北京義翹神州生物科技有限公司；兔抗人PARP-1多克隆抗體（ab32064）和PARP-1蛋白抑制劑（4-Aminonaph-thalimide，ab144620）購于美國Abcam公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG多克隆抗體、預染蛋白Marker、eECL試劑盒和Trizol試劑購于北京康為世紀生物科技有限公司；2×Taq PCR Mastermix、反轉錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase）、DNA Marker和BCA蛋白定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；MTT、DMEM培養基購于北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；細胞凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞抑制率：取對數生長期HCM細胞，用胰蛋白酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM培養基懸浮，調節細胞濃度至1×107個細胞/mL，取200 μL鋪種至96孔板，待貼壁后處理組加入不同濃度的TNF-α，干預組加入TNF-α的同時加入PARP-1抑制劑，對照組（即TNF-α濃度為0時）加入同體積的0.9%氯化鈉溶液，繼續培育24 h后加入20 μL MTT溶液，繼續培育4 h后去上清并加入150 μL DMSO，

充分混勻后用酶標儀于492 nm處測吸光度，計算各組細胞的生長抑制率。

1.2.2 流式細胞儀檢測PARP-1抑制劑干預后TNF-α對HCM細胞凋亡的影響：取對數生長期的HCM細胞，鋪種至6孔板，待貼壁后處理組加入不同濃度的TNF-α，干預組分別加入不同濃度的TNF-α和PARP-1抑制劑，繼續培育24 h后消化并懸浮細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書加入FITC-Annexin V和PI染料，避光孵育后用貝克曼流式細胞儀上機檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測PARP-1基因表達：細胞處理方法同上述實驗，繼續培育24 h后收集細胞并用PBS清洗2次，加入1 mL的Trizol試劑充分混勻，按照產品說明書進行RNA抽提，用無RNA酶水溶解后用核酸蛋白測定儀檢測RNA溶液的OD260/OD280以及OD260/OD230比值和RNA濃度，取等量的RNA溶液進行反轉錄反應；反轉錄完成后用2×Taq PCR Mastermix配置PCR反應液，并加入等體積的cDNA后進行擴增。內參β-actin基因的引物序列為：β-actin-F：5’-GCAC TCTTCCAGCCTTCCTT-3’，β-actin-R：5’-AGGTCTTTGCG GATGTCCA-3’，PARP-1基因的引物序列為：PARP-1-F：5’-AGCCTTCAGGAGTTGTTCTTAG-3’，PARP-1-R：5’-GAGTG TTCCAGTCCAGAATCA-3’。擴增完成后用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠成像系統拍照后用Image J軟件對電泳條帶進行灰度值分析，并計算目的基因的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測PARP-1蛋白的表達：細胞鋪種和藥物處理如同上述MTT實驗步驟，藥物處理0、6、12、18、24、32 h后加收集細胞并加入細胞裂解液進行總蛋白提取，通過BCA法測定總蛋白后取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳、半干法轉膜、封閉，按照抗體說明書進行比例稀釋一抗并于4 ℃孵育過夜，清洗后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，清洗后用eECL試劑孵育醋酸纖維素膜，暗室中進行曝光顯影。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad prism 5軟件進行統計學分析和繪圖。結果以 ±s表示，各組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞抑制率 MTT實驗結果顯示TNF-α可以抑制HCM細胞的生長，并呈濃度依賴性，其IC50濃度經Graphpad prism 5軟件計算為235 ng/mL，見圖1。用235 ng/mL的TNF-α作用于HCM細胞的同時，加入不同濃度的PARP-1抑制劑進行干預，24 h后MTT法檢測細胞抑制率，結果顯示干預組的細胞生長抑制率低于處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.2 細胞凋亡 不同的TNF-α濃度處理HCM細胞24 h后經PE-Annexin-V和7-AAD雙染色后上機檢測，結果顯示細胞主要以凋亡為主，并呈濃度依賴性，見圖3A。干預組中各濃度的TNF-α加入PARP-1抑制劑（100 ng/mL）干預后的細胞凋亡比率與相同濃度TNF-α處理組比較明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖1 TNF-α對HCM細胞的生長抑制作用

圖2 不同濃度的PARP-1抑制劑干預TNF-α對HCM細胞的生長抑制作用

圖3 PARP-1蛋白抑制劑干預TNF-α對HCM細胞凋亡的誘導作用

2.3PARP-1基因表達 HCM細胞在TNF-α誘導后，通過RT-PCR分析PARP-1基因的mRNA表達水平，結果顯示100～250 ng/mL濃度的TNF-α誘導后PARP-1基因的mRNA表達水平明顯上升，與對照組（TNF-α濃度為0）比差異有統計學意義（P＜0.05）；50 ng/mL濃度的TNF-α處理HCM細胞后PARP-1基因的mRNA表達水平與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4AB。PARP-1抑制劑（100 ng/mL）對TNF-α進行干預，各個濃度的TNF-α處理HCM細胞后PARP-1基因的mRNA表達水平均出現明顯下調，與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），但加入PARP-1抑制劑的干預組中，各不同濃度TNF-α組間相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4C-D。

2.4 PARP-1蛋白表達 Western blot結果顯示TNF-α處理HCM細胞后PARP-1蛋白水平均表達下調，并呈濃度依賴性，但是PARP-1裂解產物cleaved-PARP-1的蛋白水平卻隨著TNF-α處理濃度增加而遞增，與對照組比差異有統計學意義（P＜0.05）。在加入100 ng/mL的PARP-1抑制劑的干預組中，不同濃度TNF-α處理HCM細胞后PARP-1和cleaved-PARP-1蛋白與對照組比差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 不同濃度TNF-α以及PARP-1抑制劑干預對HCM細胞PARP-1基因表達的影響

3 討論

急性心肌梗死是一種由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂導致冠狀動脈血供急劇減少甚至中斷或血栓性阻塞，使得心肌嚴重或者持久地缺血，引起心肌細胞壞死的疾病。重癥醫學和經皮冠狀動脈介入治療的發展實現了為患者盡早恢復血流供應，但在恢復血流灌注的同時不可避免地會引發心肌缺血-再灌注損傷，導致各種并發癥。研究發現TNF-α和PARP-1蛋白在缺血再灌注損傷誘導細胞凋亡過程中有著重要的作用。TNF-α作為參與炎癥反應調節的重要因子，在AMI發病過程中發揮著重要作用，對動脈粥樣硬化患者發生心血管事件危險分層意義重大[8]。國內學者通過米諾環素處理經冠狀動脈左前降支結扎缺血/再灌注損傷模型大鼠的研究發現，米諾環素可能是通過抑制心肌細胞和外周血白細胞中PARP蛋白過度活化而減輕對大鼠心肌細胞損傷[9]，還有研究表明PARP-1蛋白抑制劑具有減少心肌梗死面積、減弱心肌功能障礙、促進心臟停搏后心肌功能恢復等心肌保護作用[10-12]。

盡管以上文獻報道說明通過抑制PARP-1蛋白的活性具有保護心肌細胞的功能，但是其具體作用機制仍未闡明，因此，本研究通過TNF-α處理HCM人心肌細胞并誘導細胞凋亡，建立心肌細胞缺血再灌注損傷模型，干預組通過PARP-1抑制劑對心肌細胞凋亡壞死過程進行干預，逆轉細胞凋亡壞死，從而保護心肌細胞。實驗結果顯示不同濃度的TNF-α對HCM細胞具有一定的生長抑制作用，特別是終濃度為200 ng/mL條件下對HCM細胞的生長抑制作用明顯增強，但是通過PARP-1抑制劑干預后，明顯降低TNF-α對細胞生長抑制作用，并表現對PARP-1抑制劑具有濃度依賴性。細胞凋亡檢測實驗結果也顯示PARP-1抑制劑干預后Annexin-V陽性比例較未干預組有明顯降低。本研究還通過RT-PCR和Western blot實驗分析HCM細胞在不同濃度的TNF-α以及PARP-1抑制劑干預作用下PARP-1基因的mRNA和蛋白表達水平。實驗結果顯示TNF-α可以誘導HCM細胞中PARP-1基因的mRNA上調表達，但是在蛋白表達水平上伴隨其裂解產物cleaver-PARP上調，PARP-1蛋白水平出現下調。在不同濃度的TNF-α處理HCM細胞的同時加入PARP-1抑制劑可以逆轉細胞中PARP-1基因的上調表達，并且在0 ng/mL的TNF-α處理組細胞中PARP-1基因同樣也出現下調表達，但是對蛋白水平分析結果顯示PARP-1和cleaved-PARP的表達量與對照組相比未見明顯差異，但是在細胞增殖實驗和細胞凋亡實驗組中均發現PARP-1抑制劑對HCM細胞增殖和誘導細胞凋亡具有明顯的影響，因此推測TNF-α誘導細胞凋亡過程中可能還存在其他信號途徑。

據文獻報道，TNF-α可以在無DNA損傷的情況下通過TNFR1/ERK2信號途徑介導PARP-1蛋白磷酸化從而激活PARP-1的酶活性，并且TNF-α在激活NF-κB的轉錄活性過程中表現出對PARP-1的酶活性的依賴性[13]。還有學者通過對未經LPS處理的小膠質細胞的研究發現PARP-1可以持續與IL-1β和TNF-α的啟動子結合，經LPS誘導后ADP-核糖化作用將NF-κB招募至IL-1β和TNF-α的啟動子同源區從而誘導炎癥因子的表達[14]。

圖5 處理組和干預組HCM細胞中PARP-1和cleaved-PARP-1表達

本研究結果提示TNF-α通過誘導HCM細胞PARP-1活化和蛋白裂解，從而介導細胞凋亡，PARP-1抑制劑通過抑制PARP-1蛋白活化和基因的轉錄逆轉TNF-α對HCM細胞的生長抑制和細胞凋亡誘導作用，但是具體的分子機制和參與的信號途徑，以及PARP-1抑制劑干預是否對NF-κB的轉錄活性以及相關炎癥因子的表達產生影響均尚未闡明。盡管如此，PARP-1仍可能成為降低心肌梗死引起的缺血再灌注對心肌細胞損傷理想的靶標。

[1] TIAN M, YUAN Y C, LI J Y, et al. Tumor necrosis factor-a and its role as a mediator in myocardial infarction: A brief review[J]. 慢性疾病與轉化醫學 (英文), 2015, 1(1):18-26.

[2] EREMENKO A A, CHERNOVA E V, VINNITSKI? L I, et al.Effect of clarithromycin on the systemic inflammatory response syndrome severity in patients after myocardial revascularization surgery[J]. Anesteziol Reanimatol, 2012(3): 67-71.

[3] ADAMY C, LE C P, CANDIANI G, et al. Tumor necrosis factor alpha and glutathione interplay in chronic heart failure[J]. Arch Mal Coeur Vaiss, 2005, 98(9): 906-912.

[4] DE MURCIA J M, NIEDERGANG C, TRUCCO C, et al.Requirement of poly (ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(14): 7303-7307.

[5] GIBSON B A, KRAUS W L. New insights into the molecular and cellular functions of poly (ADP-ribose) and PARPs[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(7): 411-424.

[6] SISTIGU A, MANIC G, OBRIST F, et al. Trial Watch-Inhibiting PARP enzymes for anticancer therapy[J]. Mol Cell Oncol, 2015, 3(2): e1053594.

[7] BERGER N A, SIMS J L, CATINO D M, et al. Poly (ADP-ribose) polymerase mediates the suicide response to massive DNA damage: studies in normal and DNA-repair defective cells[J]. Princess Takamatsu Symp, 1983, 13: 219-226.

[8] KABLAK-ZIEMBICKA A, PRZEWLOCKI T, SOKO?OWSKI A, et al. Carotid intima-media thickness, hs-CRP and TNF-α are independently associated with cardiovascular event risk in patients with atherosclerotic occlusive disease[J]. Atherosclerosis, 2011, 214(1): 185-190.

[9] 張利群, 陳冬, 齊國先. 米諾環素后處理通過抑制P A R P過度活化減輕心肌缺血/再灌注損傷[J]. 中國病理生理雜志,2 0 1 5, 3 1(1 1): 2 0 0 9-2 0 1 5.

[10] YAMAZAKI K, TANAKA S, SAKATA R, et al. Protective effect of cardioplegia with poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor against myocardial ischemia-reperfusion injury:in vitro study of isolated rat heart model[J]. J Enzyme Inhib Med Chem, 2013, 28(1): 143-147.

[11] KHAN T A, RUEL M, BIANCHI C, et al. Poly (ADP-ribose) polymerase inhibition improves postischemic myocardial function after cardioplegia-cardiopulmonary bypass[J].J Am Coll Surg, 2003, 197(2): 270-277.

[12] SZABó G, BUHMANN V, ANDRáSI T, et al. Poly-ADP-ribose polymerase inhibition protects against myocardial and endothelial reperfusion injury after hypothermic cardiac arrest[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003, 126(3): 651-658.

[13] VUONG B, HOGAN-CANN A D, ALANO C C, et al. NF-κB transcriptional activation by TNFα requires phospholipase C, extracellular signal-regulated kinase 2 and poly(ADP-ribose) polymerase-1[J]. J Neuroinflamm, 2015, 12:229.

[14] MARTINEZ-ZAMUDIO R I, HA H C. PARP1 enhances inflammatory cytokine expression by alteration of promoter chromatin structure in microglia[J]. Brain Behav, 2014, 4(4):552-565.

（本文編輯：趙翠翠）

PARP-1 protein inhibitor attenuated the growth inhibition and apoptosis of human cardiomyocytes in- duced by TNF-α

XIE Yuequn1, WANG Lei1, CHEN Linglong1, XU Ying1, YANG Zhitao2, LU Zhongqiu3.1.Department of Emergency, Wenzhou People’s Hospital, the Third Clinical Institute Affiliated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Emergency, Ruijin Hospital Shanghai JiaoTong University School of Medicine, Shanghai, 200025; 3.Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.006

2017-01-10

浙江省醫學創新學科建設計劃項目（11-CX26）；浙江省中醫藥重點學科計劃項目（2012-XK-A28）；浙江省“十二五”重點學科建設項目（2012-207）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20170736）。

謝月群（1985-），女，浙江瑞安人，主治醫師，碩士。

盧中秋，主任醫師，Email：lzq640815@163.com。