苯那普利對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達的影響

趙燕云，項協隆，簡怡娟，董飛俠，3

（1.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院腎內科，浙江 溫州 325000；3.溫州老年病醫院 腎內科，浙江 溫州 325000）

苯那普利對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達的影響

趙燕云1，項協隆2，簡怡娟2，董飛俠2，3

（1.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院腎內科，浙江 溫州 325000；3.溫州老年病醫院 腎內科，浙江 溫州 325000）

目的：觀察苯那普利對單側輸尿管梗阻大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表達的影響，探討苯那普利對腎間質纖維化的作用機制。方法：將54只SPF級SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、苯那普利組，每組18只。苯那普利組予1.6 mg/kg苯那普利灌胃給藥，每天1次，模型組、假手術組予10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次。模型組和苯那普利組大鼠均結扎左側輸尿管制備單側輸尿管梗阻腎纖維化模型。各組分別于造模第7、第14、第21天隨機處死6只大鼠，取左側腎臟組織做病理檢測，Masson法觀察腎纖維化程度，免疫組織化學染色檢測腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4的表達，PCR檢測NOX4的表達情況。結果：與假手術組比，模型組大鼠腎間質纖維化程度加重，且隨著輸尿管梗阻時間延長而加重（P＜0.05）；與模型組比較，苯那普利組大鼠腎間質纖維化程度減輕（P＜0.05）。免疫組織化學染色與PCR結果顯示：與假手術組比，模型組腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達明顯增多（P＜0.05）；與模型組比，苯那普利組大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表達降低（P＜0.05）。結論：苯那普利能下調單側輸尿管梗阻大鼠腎小管TGF-β1、α-SMA、NOX4的表達，可能是其抗腎纖維化作用的機制之一。

單側輸尿管結扎；轉化生長因子-β1；α平滑肌肌動蛋白；NADPH氧化酶；腎纖維化；苯那普利

Abstract: Objective:To observe the effects of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction (UUO) and investigate the mechanism of it in renal interstitial fibrosis.Methods:The male Sprague-Dawley (SD) rats (54 cases) were randomly divided into Sham-operated group, model group and Benazepril treated group, 18 rats in each group. The benazepril group was given 1.6 mg/kg intragastric administration 1 times a day, and the model group and the sham operation group were given 10 mL/kg 0.9% sodium chloride solution gavage 1 times a day, model group and the benazepril group were ligated left ureter to establish UUO models. At days 7, 14 and 21, six rats in each group were sacrificed. Their left surgery renal tissues were collected for pathological examination. The pathological changes of the obstruction renal tissue were examined by Masson staining. The protein and gene expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 was detected by immunohistochemical staining respectively and NOX4 was detected by RT-PCR.Results:Compared with the Sham-operation group, the renal interstitial fibrosis degree of rats in other groups was increased(P＜0.05), and aggratated as the ureteral obstruction time prolonged. Compared with the model group, after the treatment, the renal interstitial fibrosis degree decreased significantly (P＜0.05). Compared with the Sham-operation group, the protein expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in other group increased (P＜0.05). Compared with the model group, after the treatment by Benazepril, the protein expression TGF-β1, α-SMA, NOX4 was down-regulated in the renal tissue (P＜0.05). Conclusion: Benazepril may effectively retard kidney interstitial fibrosis by reducing the expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 to inhibit inflammatory of kidney.

Key words:unilateral ureteral obstruction; TGF-β1; α-SMA; NOX4; renal interstitial fibrosis; Benazepril

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是導致終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的全因死亡高危因素。干預早、中期的CKD對預防其進展到ESRD尤其重要。腎臟纖維化是CKD進展的共同通路，所以，抑制腎臟纖維化是CKD早、中期治療的關鍵環節。研究證實NOX4信號通路在調節炎癥、抑制腎纖維化中發揮重要作用[1]。苯那普利通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），降低腎小球囊內壓、高灌注、高濾過，延緩慢性腎臟病的進展。本研究通過觀察苯那普利對單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎纖維化大鼠模型NOX4、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1，）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的影響，探討其抗腎纖維化的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠54只，體質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002，分籠飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，人工光照，明暗各12 h，飼養期間進食標準飼料，自由飲水。

1.1.2 藥物與試劑：苯那普利（上海延慕實業有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1抗體（美國Santa公司）；兔抗大鼠α-SMA抗體、兔抗大鼠NOX4單克隆抗體（美國Abcam公司）；GTVisionTM I I I抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒（上海基因科技有限公司）；HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）。

1.1.3 儀器：組織脫水機（KD-TS3A，鄭州南北儀器設備有限公司）；病理切片機（RM2235，德國Leica公司）；光學顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；電子天平（FA2004N，上海精密科學儀器有限公司）；微量加樣槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥：54只SPF級雄性SD大鼠適應性飼養5 d后，按隨機數字表法分為假手術組（n=18）、模型組（n=18）和苯那普利組（n=18）。模型組和苯那普利組采用結扎單側輸尿管建立腎間質纖維化大鼠模型：禁食不禁水12 h，稱體質量，以10%水合氯醛（3.5 μL/g）腹腔注射麻醉，取右側臥位固定于手術臺，剪除左側腹部被毛，常規碘伏消毒，從背部距左側肋脊角1.5 cm處做1.2～1.5 cm的斜向切口，逐層剪開皮膚、肌肉，開腹后暴露左側腎臟，游離左輸尿管，分別于約腎盂處和輸尿管上1/3處雙重結扎，后納腎歸原位，然后逐層縫合。假手術組開腹后分離左側輸尿管，但不結扎[1]。造模后第2天開始給藥，每日稱體質量，假手術組、模型組予10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，苯那普利組予苯那普利灌胃，劑量為1.6 mg/kg，每天1次。

1.2.2 標本收集和處理：各組大鼠分別于給藥第7、第14、第21天后隨機取6只，禁食不禁水1 d后處死，取左腎，除去包膜，放出積水，迅速分切腎組織，將其中一份于中性甲醛溶液中固定，其余組織用0.9%氯化鈉溶液沖洗后迅速置于液氮中凍存，轉置-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 指標檢測

1.3.1 大鼠一般情況：觀察各組大鼠造模后、給藥過程中的精神狀態、活動度、體毛色澤以及大便形狀等情況。

1.3.2 Masson染色：取經中性甲醛溶液固定24 h的腎臟組織標本，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm厚石蠟切片，按常規方法行Masson染色后進行腎間質纖維化指數評分：在400倍視野下，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機選取5個互不重疊的腎皮質區腎小管間質視野，計算視野中膠原染色陽性面積占整個視野面積的百分比，然后取平均值。標準如下：0分，纖維化陽性面積＜2%；1分，纖維化陽性面積2%～10%；2分，纖維化陽性面積11%～20%；3分，纖維化陽性面積21%～30%；4分，纖維化陽性面積＞30%[2]。

1.3.3 免疫組織化學染色：采用免疫組織化學法檢測腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達。3 μm石蠟切片，常規脫蠟水化，枸櫞酸鹽緩沖液（pH值6.0）中高壓煮沸修復抗原，加3% H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封閉液封閉30 min，滴加一抗，TGF-β1（1∶100）、α-SMA（1∶500）、抗NOX4（1∶100），4 ℃過夜；滴加聚合辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察，棕黃色部分為陽性染色，每張切片隨機選取5個非重疊視野，使用Image Pro Plus軟件分析每張圖像中陽性染色面積百分比，取其平均值作為本張切片的結果。

1.3.4 RT-PCR法檢測腎組織NOX4 mRNA表達：提取腎組織總RNA后，用紫外分光光度計測各組樣品RNA純度，以20 μL為體系進行反轉錄反應，以25 μL為反應體系進行PCR擴增，內含25×SYBR Green I熒光染料1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水14.7 μL，cDNA 1.0 μL，每個樣本設3個復孔。反應程序為95 ℃預變性90 s，退火5 s，58 ℃延伸30 s，共40個循環，每個循環結束后采集熒光信號。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以 ±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 假手術組大鼠術后第1天飲食飲水、活動恢復正常，精力充沛，被毛光澤，大便正常；模型組大鼠術后飲食飲水、活動度恢復較慢，精神欠佳，大便偏硬；苯那普利組大鼠術后3 d開始恢復正常飲食飲水，精神尚可，活動較假手術組稍少，大便軟。各組大鼠體毛肉眼觀察未見明顯區別，光澤度均可。

2.2 Masson染色 假手術組腎組織Masson染色未見明顯病理改變，僅見腎小管基膜處呈線狀分布的藍染的膠原組織。模型組隨著梗阻時間的延長，間質中藍染的膠原纖維逐漸增多，提示纖維化進行性加重。膠原半定量分析顯示，與假手術組比，模型組纖維化指數顯著增加（P＜0.05），隨著梗阻時間延長，腎小管間質纖維化逐漸加重（P＜0.05）。與模型組比，經苯那普利治療后，腎纖維化指數減輕（P＜0.05）。見表1和圖1。2.3 TGF-β1表達 假手術組TGF-β1有微量表達，模型組大鼠腎小管上皮細胞、炎性細胞、間質成纖維細胞中TGF-β1均有不同程度的表達，在病變腎小管上皮細胞內表達更為顯著，隨著時間延長，TGF-β1所占陽性面積百分比逐漸加重，差異均有統計學意義（P＜0.05），且均顯著高于假手術組（P＜0.05）。與模型組比較，苯那普利組TGF-β1表達均有降低（P＜0.05）。見表2和圖2。

表1 各組大鼠不同時間的腎間質纖維化指數（n=6， ±s）

圖1 Masson染色評價腎間質纖維化情況（×400）

表2 各組大鼠腎間質中TGF-β1表達陽性面積百分比（n=6，±s，%）

圖2 各組腎組織中TGF-β1的表達（×400）

2.4 α-SMA的表達 在假手術組中，僅見小動脈層中表達棕褐色的α-SMA，腎間質中未見表達。模型組可見腎間質中出現大量α-SMA表達，隨著梗阻時間延長，各模型組腎間質α-SMA的表達量增加，且均顯著高于假手術組（P＜0.05）。與模型組比，經苯那普利治療后表達降低（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組大鼠腎間質中α-SMA表達陽性面積百分比（n=6，±s，%）

2.5 NOX4的表達 假手術組腎組織中只有少量NOX4表達，在相應時間點模型組NOX4的表達明顯高于假手術組（P＜0.01）；與模型組比，苯那普利組NOX4表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4和圖4。

表4 各組腎組織中NOX4表達陽性面積百分比（n=6，±s，%）

2.6 NOX4 mRNA表達 各組大鼠腎臟均有NOX4 mRNA表達，假手術組有較弱表達，模型組、苯那普利組大鼠腎組織表達較假手術組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。苯那普利組表達較模型組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

圖3 各組腎組織中α-SMA的表達（×400）

3 討論

研究發現中國成年人群CKD的患病率高達10.8%，并呈逐年上升趨勢[1]。腎間質纖維化是多種腎臟病的基本病理基礎，與腎小球硬化相比，腎間質纖維化與腎功能減退關系更為密切[2]。腎纖維化是慢性腎臟病發展至終末期的共同途徑，TGF-β1在腎纖維化的發生發展中發揮重要作用。TGF-β1啟動并調節上皮細胞向間充質細胞轉化的全過程，是腎纖化過程的中心介導者和主要途徑[3-4]。α-SMA是上皮細胞轉分化的指標，是肌成纖維細胞產生的標志[5]，是腎纖維化發生發展過程中最重要的因子之一[6]。本研究結果顯示，造模后TGF-β1、α-SMA表達明顯上調，且隨著梗阻時間的延長，表達逐漸增加，表明模型組大鼠發生了上皮細胞轉分化，且隨著時間延長，上皮細胞間充質轉化的程度加重；經過苯那普利治療后，TGF-β1、α-SMA表達量降低。已有研究表明苯那普利是通過下調TGF-β1、α-SMA蛋白水平的表達從而抗上皮細胞轉化作用[7-8]。

腎間質纖維化的發生發展與腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）密切相關，阻斷RAS對腎有保護作用。苯那普利對血管緊張素轉換酶有較強的抑制作用，引起血漿血管緊張素I I（angio-tensin，Ang I I）濃度減低，并導致血漿腎素活性增加和醛固酮水平降低，抑制Ang I I在腎臟的血流動力學及非血流動力學的作用，特別是Ang I I也可以刺激NOX的多個亞基使之激活，產生ROS以及H2O2，并導致線粒體內ROS的積聚，而ROS又可以作為Ang I I的信號分子去執行Ang I I的細胞毒性作用[9]，從而抑制NOX的多個亞基激活，緩解腎纖維化進展。NOX有7種亞型，分別為NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[10]，在腎組織中表達的主要是NOX4，主要在腎小管中表達，可能作為一種敏感性氧感受器。RAAS的激活促進NOX4產生過量的ROS，氧化應激的水平升高，促進腎纖維化，NOX產生的ROS介導Ang I I、TGF-β1、蛋白激酶C促腎纖維化，與腎間質纖維化的發生發展有著密切的聯系[11]。本研究結果表明，苯那普利通過抑制RAS激活，抑制Ang I I水平，下調NOX4的基因表達；苯那普利組與模型組比，病理腎間質纖維化指數降低，表明苯那普利除了抑制Ang I I在腎臟的血流動力學作用，同時從非血流動力學方面，下調NOX4的表達，減輕氧化損傷，改善UUO腎臟病理，改善腎間質纖維化的進展。

圖4 各組腎組織中NOX4的表達（×400）

表5 各組大鼠腎間質中NOX4 mRNA相對表達量（n=6，±s）

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（本文編輯：趙翠翠）

Effect of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA and NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction

ZHAO Yanyun1, XIANG Xielong2, JIAN Yijuan2, DONG Feixia2,3. 1.Department ofPharmacology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Nephrology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 3.Department of Nephrology, Wenzhou Geriatric Hospital, Wenzhou, 325000

R966

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.005

2017-03-20

浙江省自然科學基金資助項目（LY14H270001）；浙江省中醫藥管理局課題（2013ZB121）；溫州市科技計劃項目（Y20170692）。

趙燕云（1973-），女，內蒙古烏蘭察布人，副主任藥師。

董飛俠，主任醫師，Email：cgrsfhtd@163.com。