丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基通過活化Toll樣受體4影響單核細胞分泌細胞因子

楊再興，梁艷，劉東紅，張治宇，仲人前

（1.臺州市第一人民醫院 檢驗科，浙江 臺州 318020；2.上海長征醫院 實驗診斷科，上海 200003；3.上海長征醫院 貴賓科，上海 200003）

丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基通過活化Toll樣受體4影響單核細胞分泌細胞因子

楊再興1，梁艷2，劉東紅1，張治宇3，仲人前2

（1.臺州市第一人民醫院 檢驗科，浙江 臺州 318020；2.上海長征醫院 實驗診斷科，上海 200003；3.上海長征醫院 貴賓科，上海 200003）

目的：探討丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（PDC-E2）是否可以活化Toll樣受體4（TLR4）-NF-κB通路，并通過該通路誘導單核細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素12（IL-12）和可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（sTRAIL）。方法：培養單核細胞株U937，分為空白對照組、PDC-E2組、PDC-E2+HTA125組和PDCE2+PDTC組?？瞻讓φ战M不予任何刺激；PDC-E2組予2、10和50 μg/mL的PDC-E2刺激；PDC-E2+HTA125組予10 μg/mL的TLR4功能抑制抗體HTA125孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2；PDC-E2+PDTC組加入100 nmol/mL的NF-κB抑制劑PDTC 0.5 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2。通過流式細胞術檢測TLR4表達，EMSA實驗檢測NF-κB活化情況，ELISA法檢測培養上清TNF-α、IL-12和sTRAIL濃度。結果：2、10和50 μg/mL濃度PDC-E2刺激U937細胞24 h，TLR4表達均明顯增加，但無濃度依賴性。濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細胞1 h，NF-κB即顯著活化；至2 h，活化逐漸減少；至4 h，已明顯減少。加入HTA125后，NF-κB活性較阻斷前顯著降低。濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細胞24 h，培養上清TNF-α和sTRAIL的濃度顯著高于空白對照組（P＜0.05），IL-12與空白對照組比差異無統計學意義；至48 h和72 h，TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。加入HTA125或PDTC后，各時間點3種細胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。結論：PDC-E2可以活化TLR4-NF-κB通路，并通過該通路刺激單核細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL。

丙酮酸脫氫酶復合體；Toll樣受體4；核因子；細胞因子；原發性膽汁性膽管炎

Abstract: Objective:To explore whether pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit (PDC-E2) may activate Toll-like receptor 4 (TLR4)-NF-κB pathway and induce secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-12 (IL-12) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (sTRAIL).Methods:PDC-E2 was used to stimulate monocyte line U937, combined with HTA125 (an inhibitory antibody of TLR4) and PDTC (an inhibitor of NF-κB). The study groups included control group, PDC-E2 group, PDC-E2+HTA125 group and PDCE2+PDTC group. TLR4 on U937 was detected by flow cytometry, activity of NF-κB was determined by EMSA,TNF-α, IL-12 and sTRAIL were measured by ELISA.Results:At 24 h after stimulation by 2, 10 and 50 μg/mL of PDC-E2, TLR4 expression on U937 cell was significantly increased. At 1 h after stimulation by 50 μg/mL of PDC-E2, NF-κB was markedly activated, while at 2 h, the activation of NF-κB was gradually decreased and at 4 h, the decrease was very significant. NF-κB activity was significantly decreased after HTA125 addition compared with that before. At 24 h after stimulation by 50 μg/mL of PDC-E2, supernant TNF-α and sTRAIL levels were significantly higher than that of control, while IL-12 level was of no significant difference. At 24 h and 48 h, the levels of TNF-α, IL-12 and sTRAIL were all significantly higher than that of control. The three cytokines were significantly lower after addition of HTA125 or PDTC than before.Conclusion:PDC-E2 can activate TLR4-NF-κB pathway, by which PDC-E2 stimulates the secretion of TNF-α, IL-12 and sTRAIL by monocyte.

Key words:pyruvate dehydrogenase complex; Toll-like receptor 4; nuclear factor; cytokine; primary biliary cholangitis

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種以肝內門管區中小膽管炎癥性損傷為主要表現的慢性自身免疫性肝病，其病因和發病機制未明。該疾病的特征性標志是血清抗線粒體抗體陽性，該抗體的靶抗原主要是丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit，PDC-E2）。研究發現，PDC-E2抗原特異性T淋巴細胞可能在PBC的發病過程中發揮重要作用[1]。PDC-E2抗原通過抗原遞呈細胞如樹突狀細胞、單核巨噬細胞等遞呈給T細胞，引起后者活化，而發揮作用。研究證實，在PBC的肝組織門管區存在大量單核巨噬細胞的浸潤[2-4]，但PDC-E2對單核巨噬細胞本身有何生物學作用目前尚不明確。因此，本研究探討PDC-E2對單核細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達，轉錄因子NF-κB活化，TNF-α、IL-12、可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（soluble tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，sTRAIL）分泌的影響，以及TLR4通路及NF-κB對PDC-E2上述生物學功能的調節作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 PE-Cy5標記鼠抗人TLR4單抗和抗TLR4功能阻斷性單抗HTA125（eBioscience，美國）；NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）（Sigma，美國）；TNF-α和IL-12 ELISA檢測試劑盒（Bender，美國）；sTRAIL ELISA檢測試劑盒（Diaclone，法國）；NF-κB活性檢測試劑盒（Active Motif，美國）；胎牛血清、RPMI1640培養基（Gibco，美國）；75 mL細胞培養瓶、6或24孔細胞培養板（Corning，美國）；細胞核蛋白抽提試劑盒（Pierce，美國）；電泳遷移率阻滯試驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）探針標記試劑盒（Roche，德國）。PDC-E2為上海富純中南生物技術公司（現更名為上海科新生物技術股份有限公司）惠贈，并且已應用ThermoSCIENTIFIC Pierce公司的Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel去除了其中的內毒素（含量低于10 pg/mL）；U937細胞為上海長征醫院耿紅蓮博士惠贈。

1.2 主要儀器 流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；KUBOTA 5420臺式高速離心機（日本Kubota公司）；550型酶聯免疫檢測儀和水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）；721型紫外分光光度儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 U937細胞培養及PDC-E2刺激：U937細胞株培養在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養傳代。選取第3代細胞，以每孔5×105的濃度，接種至24孔板，待細胞同步化后，進行下述實驗：①分別加入2、10和50 μg/mL的PDC-E2，相同條件設3復孔，并以培養基為對照。24 h后，收集細胞，檢測細胞TLR4的表達。②加入10 μg/mL的HTA125，孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于24、48和72 h后收集培養上清用于細胞因子濃度檢測。③加入10 μg/mL的HTA125，孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于1、2和4 h后，收集細胞，抽提核蛋白，EMSA法檢測NF-κB活性。④加入100 nmol/mL的PDTC，0.5 h后，加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于24、48和72 h后收集培養上清用于細胞因子濃度檢測。

1.3.2 TLR4表達檢測：以PE-Cy5標記鼠抗人TLR4單抗，采用流式細胞儀檢測U937細胞TLR4表達水平。操作按流式細胞儀檢測流程進行。

1.3.3 NF-κB活性檢測：抽提核蛋白，EMSA法檢測核蛋白NF-κB活性，操作按試劑盒說明進行，其中標記的探針序列如下：正義序列5’-AGTTGAGGGGACT TTCCCAGGC-3’，反義序列5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCA ACT-3’，以地高辛標記。

1.3.4 細胞因子濃度檢測：采用ELISA法檢測細胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度，操作按試劑盒說明進行。

1.4 統計學處理方法 所有數據采用SPSS13.0進行統計。計量資料以 ±s表示，多組間比較采用兩因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDC-E2對U937細胞TLR4表達的調節作用 單核細胞系U937細胞在無任何刺激的情況下即表達TLR4，其陽性表達率為33.99%±0.33%。濃度為2 μg/mL的PDC-E2刺激24 h，TLR4陽性表達率有顯著增高（為44.89%±3.43%）（P＜0.05），PDC-E2濃度增加至10 μg/mL和50 μg/mL時，TLR4陽性表達率分別為44.28%±0.43%和46.24%±1.65%，與2 μg/mL刺激相比無明顯增加（P＞0.05），見圖1。對熒光強度進行分析顯示，在無任何刺激的情況下，TLR4平均熒光強度為1.61±0.05，濃度為2、10、50 μg/mL的PDC-E2刺激24 h后，TLR4平均熒光強度分別為1.74±0.01、1.77±0.02和1.85±0.10，均較刺激前明顯增加，但3種濃度之間差異無統計學意義（F=2.491，P＞0.05）。

圖1 不同濃度PDC-E2對U937細胞TLR4陽性表達的影響

2.2 HTA125阻斷TLR4活性對NF-κB活性的影響

EMSA檢測結果顯示，在無任何刺激情況下，U937細胞核內未檢測到具有結合DNA活性的NF-κB；濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細胞1 h，細胞核內具有結合DNA活性的NF-κB即顯著增加；至2 h，又逐漸減少；至4 h，已明顯減少。應用HTA125抑制TLR4功能后，再以濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細胞1、2和4 h，細胞核內具有結合DNA活性的NF-κB較阻斷前顯著減少，尤其是刺激4 h時，細胞核內已基本檢測不出具有結合DNA活性的NF-κB。見圖2。

圖2 EMSA法檢測不同時間點不同干預措施下細胞核內NF-κB結合DNA活性

2.3 應用HTA125抑制TLR4功能或PDTC抑制NF-κB活性前后，PDC-E2對U937細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的調節作用 濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細胞24 h，培養上清中TNF-α和sTRAIL的濃度顯著高于空白對照組（P＜0.05），IL-12與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；至48 h，TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度均較24 h和空白對照組顯著增加（P＜0.05）；至72 h，TNF-α和sTRAIL濃度與48 h時無顯著變化（P＞0.05），IL-12濃度較48 h顯著增加（P＜0.05），TNF-α、IL-12和sTRAIL較空白對照組顯著增加（P＜0.05）。

應用HTA125抑制TLR4功能后，各時間點3種細胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。與此相似，應用PDTC抑制NF-κB活性后，各時間點3種細胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞不同時間點培養上清TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度（n=3， ±s，pg/mL）

3 討論

研究證實，在PBC的單核巨噬細胞中，TLR4存在過表達和過度活化現象[5-7]，但原因不明。本研究發現，作為PBC特異性自身抗原，PDC-E2可以上調U937細胞TLR4的表達。U937細胞是一種具有單核細胞性質的白血病腫瘤細胞株，已作為單核/巨噬細胞模型，廣泛應用于各種體外研究[8-10]。本研究亦采用U937細胞作為單核/巨噬細胞模型。因此，我們有理由推測，PDC-E2可能是PBC單核巨噬細胞TLR4過表達和過度活化的一個重要原因。

本研究進一步發現，PDC-E2刺激U937細胞后，除了可以明顯上調TLR4的表達外，還可以誘導轉錄因子NF-κB活化，促進細胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的分泌。而應用HTA125以后，NF-κB活化，TNF-α、IL-12和sTRAIL分泌受到明顯抑制，應用PDTC以后，TNF-α、IL-12和sTRAIL分泌亦受到明顯抑制。有研究證實，HTA125具有抑制TLR表達的作用，PDTC則是NF-κB的抑制劑[11-12]。本研究結果表明，PDC-E2對單核巨噬細胞分泌TNF-α、IL-12和sTRAIL的調節作用可能主要是通過活化TLR4通路，并依賴于NF-κB。當然，TLR4通路比較復雜，包括MyD88依賴和非依賴，其下游又涉及NF-κB、MAPK、干擾素調節因子等多個信號蛋白或轉錄因子[13]，本結果無法證明究竟是哪一條通路發揮的主要作用，只能初步提示PDC-E2對單核細胞的上述作用可能部分是由NF-κB介導的，對這一結果的解釋需要謹慎對待。已有研究表明，這3種細胞因子在PBC患者外周血或肝門管區均顯著增加[14-17]。TNF-α和sTRAIL可以直接誘導膽管細胞凋亡[18]，IL-12可以調節淋巴細胞的活性和功能，有助于特異性殺傷膽管上皮細胞，IL-12刺激活化的信號通路已被證實對PBC發病起重要作用[19]。

綜上所述，PDC-E2不僅可以作為一種自身抗原，指引抗原特異性T細胞殺傷肝內膽管上皮細胞，造成PBC的炎癥損傷，還可以部分活化TLR4通路，刺激單核巨噬細胞分泌對PBC發病具有重要作用的細胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL，且NF-κB在其中可能發揮一定的作用。由于技術的局限性，本研究無法證實PDC-E2是否可以作為TLR4的一個內源性配體與TLR4直接結合發揮作用，但正反兩方面功能驗證均證實PDC-E2是可以活化TLR4通路的。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Biological effect of pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit on monocyte U937 by activating Toll-like receptor 4-NF-κB pathway

YANG Zaixing1, LIANG Yan2, LIU Donghong1, ZHANG Zhiyu3, ZHONG Renqian2.1.Department of Laboratory Medicine, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 2.Department of Laboratory Diagnostics, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 200003; 3.Department of VIP, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 200003

R392.32

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.003

2016-11-23

國家自然科學基金面上項目（81671594，81571591）。

楊再興（1978-），男，遼寧錦州人，研究員，博士。