包載姜黃素納米膠束的制備與體外抗腫瘤評價

范子梁，金冰慧，徐霞芳，蔣巧穎，徐荷林

（溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

·論 著·

包載姜黃素納米膠束的制備與體外抗腫瘤評價

范子梁，金冰慧，徐霞芳，蔣巧穎，徐荷林

（溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

目的：構建載姜黃素納米膠束，體外評價其對C6腦膠質瘤細胞的生長抑制作用。方法：合成新型十一烯酸-接枝-ε-多聚賴氨酸（ε-PLL-UNA）聚合物，并對其結構進行表征，采用芘熒光探針法對其臨界膠束濃度進行測定；以ε-PLL-UNA為材料，采用透析法制備載姜黃素納米膠束，以動態光散射和透射電鏡對其粒徑、形態進行表征，以動態透析法測定藥物釋放行為，以激光共聚焦顯微鏡觀察體外細胞攝取性，以腫瘤球模型考察其體外抗腫瘤作用。結果：1H-NMR和FT-IR結果表明ε-PLL-UNA聚合物成功合成，其臨界膠束濃度為0.19 g/L，能自發組裝成膠束；載姜黃素納米膠束載藥量能達到12.22%±2.13%、包封率則高達85.12%±3.64%，平均粒徑為（60.6±2.1）nm、Zeta電位為（28.2±5.6）mV，具有球形微觀結構；該納米膠束48 h釋放84%的姜黃素，體外快速被C6細胞攝取；與姜黃素溶液相比，該納米膠束能明顯抑制膠質瘤細胞球的生長。結論：ε-PLL-UNA聚合物膠束對姜黃素具有較高的載藥量，粒徑小于100 nm、分布均勻，體外緩慢釋放藥物，提高了C6細胞對姜黃素的攝取，而且對C6細胞球具有有效的殺傷作用。

姜黃素；膠束；聚賴氨酸；十一烯酸；神經膠質瘤；細胞球

Abstract: Objective:To prepare a novel polymer micelles encapsulating curcumin (CUR) and evaluate its anti-tumor effect on glioma in vitro.Methods:A novel polymer, undecenoic acid-grafted-ε-polylysine (ε-PLLUNA), was synthesized, and its chemical structure was confirmed by1H-NMR and FT-IR. The CAC value of ε-PLL-UNA polymer was also detected by pyrene fluorescence probe. CUR-loaded micelle was prepared by dialysis method using ε-PLL-UNA as materials, and its particle size and morphology were also studied under dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope (TEM), respectively. Furthermore, in vitro drug release profiles from CUR-Micelles were explored by dynamic dialysis method. Finally, the cellular toxicity against C6 cells spheroids and the cellular uptake of CUR-Micelles were evaluated.Results:ε-PLL-UNA polymer was successfully synthesized and able to self-assemble into micelles above its CAC value of 0.19 g/L. CUR-loaded micelle had a mean diameter of (60.6±2.1)nm, and zeta potential of (28.2±5.6)mV, exhibiting the spherical shape determined by TEM. Drug loading content and drug loading efficiency for CUR-loaded micelle were high up to 12.22%±2.13% and 85.12%±3.64%, respectively. About 84% of CUR were released from the micelles in 48 hours. CUR-loaded micelle can promote the cellular uptake of its encapsulated CUR by C6 cells, displaying a significantly higher cytotoxicity against C6 cells. Besides, the growth of C6 cells spheroids was significantly inhibited by CUR-loaded micelle.Conclusion:CUR is efficiently encapsulated in ε-PLL-UNA micelles with a particle size of less than 100 nm, which improved the cellular uptake of C6 cells. The sustained-release of CUR from CUR-loaded micelle is also observed. More importantly, CUR-Micelles has superior growth inhibition against C6 cells spheroids.

Key words:curcumin; micelles; polylysine; undecylenic acid; glioma; cells spheroids

姜黃素（curcumin，CUR）是一種天然酚類色素，廣泛存在于姜黃屬植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中，是姜黃的重要活性成分。姜黃素對機體各系統作用廣泛，具有較好的抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等藥理作用，且毒性低、不良反應小[1]。但姜黃素存在水溶性差、難吸收、易降解等缺點，限制了其在臨床上的推廣應用。為克服以上不足，可將其制成磷脂復合物、固體分散體、包合物和聚合物膠束等[2]。本實驗室以ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PLL）為親水嵌段、十一烯酸（10-Undecenoic acid，UNA）為疏水嵌段合成新型十一烯酸-接枝-ε-多聚賴氨酸（ε-PLL-UNA）聚合物。以該聚合物為納米材料，自發組裝成膠束，裝載姜黃素，制備載姜黃素納米膠束，評價其體外抗腫瘤效果。

1 材料與儀器

1.1 材料 ε-PLL-UNA（鏈段分子量：ε-PLL為5 000 Da，UNA為184 Da）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、姜黃素（98%）、芘熒光探針（分析標準品）購自上海阿拉丁公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）購自日本株式會社同仁化學研究所，DAPI購自美國Sigma公司。1.2 儀器 FD-1C冷凍干燥機（北京天德佑有限公司），JEOLJEM-2000EX透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）（日本JEOL公司），SpectraMax M3酶標儀（美國Molecular Devices公司），馬爾文納米粒度電位儀Zetasizer Nano ZSP（英國Malvern公司），Bruker Tensor 27紅外光譜儀、Bruker AV-600核磁共振儀（德國Bruker公司），Nikon A1R/A1激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 ε-PLL-UNA聚合物的合成與結構確證 稱取2 g的聚賴氨酸溶于20 mL DMSO溶液中，超聲1 h直至完全溶解。另取1 mL UNA先溶于6 mL DMSO中，加入0.750 g EDC和0.120 g NHS室溫攪拌溶解，活化UNA的羧基。將UNA/DMSO溶液緩慢滴加到ε-PLL溶液中，室溫攪拌反應24 h后，用1 L蒸餾水透析48 h（每隔8 h，換水1次），凍干得到固體粉末。

真空干燥的ε-PLL-UNA聚合物粉末約5 mg與200 mg KBr粉末充分研磨混合，壓片制樣，KBr空白片扣除背景，掃描范圍4 000～400 cm-1。分辨率為4 cm-1，譜峰讀數精度為0.01 cm-1。ε-PLL-UNA的核磁共振氫譜鑒定在Bruker AV-600核磁共振儀上完成，所有樣品經過DMSO-d6處理。

2.2 臨界膠束濃度測定 熒光探針芘標準貯備溶液的配制（6×10-6mol/L）：用分析天平準確地稱取0.0012 g芘，燒杯中用適量丙酮溶解后轉入1 L容量瓶中，用丙酮定容并搖勻，配制得到濃度為6×10-6mol/L的芘丙酮貯備溶液，使用時在膠束水溶液中保持6×10-7mol/L的最終濃度。

膠束系列標準工作溶液的配制：分別取1 mL配制的芘丙酮溶液于8個燒瓶中，讓其完全揮發備用。再稱取100 mg凍干材料粉末于1 L容量瓶中，加水溶解定容，取不同量上述膠束溶液進行稀釋，配制8個不同的溶液濃度，分別為0.72、0.36、0.144、0.072、0.036、0.0144、0.0072、0.0036 g/L；將不同濃度的膠束水溶液分別取10 mL，分別加入上述含芘的燒瓶中。

2.3 載姜黃素納米膠束的制備 稱取8～16 mg姜黃素以及100 mg ε-PLL-UNA聚合物，溶于6 mL DMSO中，磁力攪拌使其完全溶解；在劇烈攪拌下，將4 mL姜黃素DMSO溶液緩慢滴入聚合物溶液中，室溫避光攪拌5 min，混合均勻，將混勻后液體轉移至透析袋內（透析膜截留分子量為3 500 Da），對蒸餾水透析24 h，開始每隔12 h換水1次除去有機溶劑，5 000 r/min離心除去藥物沉淀，得上清液，即為載姜黃素納米膠束（CUR-Micelles）。選取不同總投藥量（8、10、12、14、16 mg），固定材料每次用量為100 mg，以考察最大載藥量和包封率。

2.4 載姜黃素納米膠束的表征 聚合物納米粒水溶液過0.45 μm膜，經適當稀釋后，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm、散射角90°，使用動態光散射激光粒度測定儀（dynamic light scattering，DLS）測定納米膠束粒徑和Zeta電位；TEM檢測納米膠束形態，取載藥納米膠束滴于鋪有碳膜的銅網上，以無纖維濾紙從銅網邊緣吸掉多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中以100 kV加速電壓檢視、拍照。

2.5 載姜黃素納米膠束體外釋放 取1 mL載藥量為200 μg姜黃素納米膠束加至透析袋內（截留分子量為3 500 Da），扎緊密封兩端，放置在含有0.5%吐溫80的10 mL pH 7.4 PBS釋放介質中，置水浴搖床于37 ℃，120 r/min震搖，不同時間點用全新的10 mL釋放介質替換原有的介質，用紫外分光光度計測定姜黃素在431 nm的吸光度，代入標準曲線換算濃度，計算累積釋放率，繪制釋放曲線。以DMSO溶解的姜黃素溶液劑（CUR solution）作為對照，采用同樣的方法進行體外釋放實驗。

2.6 載姜黃素納米膠束的載藥量及包封率測定

2.6.1 紫外分光光度法測定姜黃素濃度方法的建立：準確移取150 μg/mL姜黃素儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL于10 mL容量瓶中，用DMSO定容，搖勻，待測。用紫外分光光度計在431 nm波長下測定吸光度，根據所得的吸光度A和相應的濃度C作標準曲線。

精密量取空白納米膠束1 mL（20 mg/mL）置于10 mL量瓶中，分別加入姜黃素儲備液0.3、0.5、0.7 mL，配制成質量濃度為4.5、7.5、10.5 μg/mL的溶液，每個濃度水平3份，加DMSO超聲波（240 W，40 kHz）處理20 min，DMSO稀釋至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，紫外檢測431 nm的吸光度，帶入標準曲線換算成濃度。

2.6.2 載藥量及包封率測定：取0.2 mL載藥納米膠束至10 mL容量瓶中，加入DMSO定容至刻度線，用紫外分光光度計在431 nm處測定吸光度。按照下列公式計算載藥量及包封率：

2.7 載姜黃素納米膠束的體外抗腫瘤效果

2.7.1 C6膠質瘤細胞的培養：C6膠質瘤細胞（上海生物化學與細胞生物學研究所）使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，待培養皿細胞融合率達85%，用含有0.25% EDTA的胰酶至培養箱中消化30 s，進行傳代培養。

2.7.2 CCK8法細胞毒性實驗：將對數生長期的C6細胞消化后，用培養液稀釋至4×103個/mL細胞密度，吹打后以100 μL/每孔將細胞懸液接種在96孔板中，將96孔板置細胞培養箱中孵育24 h使細胞貼壁。待貼壁后，加入100 μL含有游離藥物或載藥納米膠束的新鮮培養介質以及不做任何處理的空白對照，繼續培養24 h后，將96孔板取出，吸出所有培養基，用PBS清洗1次，每個孔加入100 μL新鮮培養基后再加入10 μL/每孔CCK8試劑，置培養箱中繼續孵育2 h后，酶標儀測定450 nm處吸光度。按照如下公式計算細胞存活率（%）。以改良寇氏計算法計算抑制50%細胞生長時的藥物濃度，即IC50值。

Atest為測試組的吸光度，Acontrol為對照組的吸光度

2.7.3 細胞攝取實驗：C6細胞以1×105個/mL密度，接種1 mL在激光共聚焦顯微鏡專用培養皿中，置細胞培養箱孵育24 h使細胞貼壁后，移去培養液，加入1 mL含有游離藥物或載藥納米膠束的細胞培養液（相當于2 μg/mL姜黃素），繼續置細胞培養箱孵育1 h或4 h。移去含藥細胞培養液，加入4 ℃的PBS終止細胞攝取，PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS沖洗3次，加入100 μL DAPI試劑，避光染色細胞核10 min，PBS沖洗3次，加入100 μL抗熒光猝滅劑封閉細胞，將培養皿置于激光共聚焦顯微鏡中拍照。

2.7.4 腫瘤球抑制實驗：取對數生長期的C6細胞，0.25%胰酶消化后吹打成單細胞懸液，用無血清培養基、含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、EGF 20 ng/mL、bFGF 20 ng/mL以及B27添加物（1×）的DMEM/F12培養液（serum-free medium，SFM）重懸，以每孔104個細胞的濃度分別接種于低吸附塑料48孔板，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，根據細胞生長的速度及培養液的顏色變化更換培養液。待細胞球直徑生長到200 μm左右時，移除培養基，加入0.5 mL含有游離藥物或載藥納米膠束的細胞培養液（相當于2 μg/mL姜黃素），觀察3 d后細胞球形態變化。

2.8 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。計量資料以 ±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 ε-PLL-UNA的合成 從聚賴氨酸、十一烯酸和產物的1H-NMR譜中，可以看到在1.1 ppm和4.0 ppm之間的峰屬于聚賴氨酸的專屬峰，峰值在3.77、3.09、1.74和1.35～1.47 ppm分別屬于聚賴氨酸骨架中次甲基[CO-CH（NH2）-]、次甲基末端（CH2NH-）和亞甲基（-CH2-CH2-）峰[3]。在十一烯酸圖譜中的1.25～1.45、2.01、2.18、4.92和5.80 ppm分別是亞甲基（-CH2-CH2-），雙鍵旁邊的亞甲基（CH2=CHCH2-），羧基旁邊的亞甲基（COOH-CH2-），次甲基（CH2=CH-）以及雙鍵末端亞甲基（CH2=CH-）。除此之外還有在11.99 ppm處有明顯特異性的羧基峰。見圖1A。而產物中峰都能在反應物中找到相應的歸屬，除了十一烯酸羧基峰消失，說明十一烯酸的羧基已和聚賴氨酸的氨基進行了反應從而導致其消失[4]。

對反應前后的紅外圖譜進行分析，結果如圖1B所示，PLL中3 238 cm-1處的強寬峰為締合氨基（N-H）伸縮振動峰，在1 671 cm-1與1 561 cm-1的2個峰分別是酰胺I帶和I I帶；UNA的2 923 cm-1和1 706 cm-1處的吸收峰分別是烯烴的C-H和羧基的C=O的伸縮振動。產物中出現的2 925、1 676 cm-1吸收峰與十一烯酸的特征峰相一致，同樣的3 247、1 681、1 570 cm-1這3個吸收峰也與聚賴氨酸的（N-H）伸縮振動峰、酰胺I帶和I I帶相對應。

圖1 十一烯酸-接枝-ε-多聚賴氨酸的1H-NMR圖譜（A）和紅外圖譜（B）

3.2 臨界膠束濃度測定 芘增溶于不同濃度的膠束溶液中的熒光發射光譜結果表明，隨著膠束濃度增加，芘的第一峰與第二峰熒光強度之比（I1/I2）依次降低，當濃度增大到一定值時曲線會發生突變，芘熒光特性的突變表明其所處環境極性的變化，即開始形成膠團（見圖2A）。I1/I2的擬合曲線結果顯示，2條擬合曲線的交點就是臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）值，ε-PLL-UNA膠束的CMC值為0.19 g/L（見圖2B）。

3.3 載姜黃素納米膠束的表征

圖2 芘在不同濃度膠束溶液中的熒光發射光譜（A）和I1/I2比值隨膠束濃度變化圖（B）

3.3.1 載藥量與包封率：透析法為制備嵌段聚合物納米膠束的經典方法，該方法制備的納米膠束載藥量和包封率等容易受處方和工藝因素的影響。通過固定工藝因素，考察嵌段聚合物的最大載藥量、包封率。紫外分光光度法測定載藥量與包封率，結果表明，姜黃素在1.5～10.5 μg/mL范圍內，吸光度A與濃度C呈線性，曲線方程A=0.13826C-0.0021，線性相關良好（R2≥0.998）。經回收率實驗表明，姜黃素低、中、高3種濃度回收率均大于95%，達到準確測定的要求。當投藥量與聚合物的比例為1∶8時，可以獲得最大載藥量和包封率，分別高達12.22%±2.13%和85.12%±3.64%。

3.3.2 載姜黃素納米膠束的表征：以最佳處方制備空白納米膠束、載藥納米膠束，分別測定其粒徑和Zeta電位結果。空白納米膠束平均粒徑為（53.7±3.4）nm和Zeta電位為（30.7±4.2）mV，姜黃素裝載對納米膠束粒徑有一定的影響，姜黃素裝載后納米膠束粒徑增大，Zeta電位基本沒有變化，其粒徑為（60.6±2.1）nm，呈現窄的粒徑分布（見圖3A），Zeta電位為（28.2±5.6）mV。

2%磷鎢酸負染后，TEM觀察納米膠束形態結果表明載藥納米膠束呈白色的球形粒子且分布均勻，TEM測量的粒徑為55 nm，比DLS測定的水合直徑稍有偏低（見圖3B）。這是因為TEM測定前需對樣品進行干燥、脫水和抽真空等處理，使載藥納米膠束水化層皺縮，納米膠束粒徑縮小[5]。

圖3 載姜黃素納米膠束的粒徑分布（A）和透射電鏡觀察（B，×100 000）

3.4 體外藥物釋放 在pH 7.4條件下，姜黃素從CUR solution和CUR-Micelles中的釋放曲線結果可以看出姜黃素從納米膠束制劑中釋放的速率明顯比溶液劑緩慢，其在溶液劑中于12 h內釋放達98%，而在納米膠束制劑中需延長至48 h釋放才到84%，見圖4。3.5 細胞毒性和細胞攝取 空白材料（ε-PLL-UNA）、CUR solution和CUR-Micelles的細胞生長抑制結果表明，ε-PLL-UNA組在整個測試濃度范圍內細胞存活率大于90%，表明其不影響細胞存活；CUR solution組在測試濃度范圍內，細胞生存率大于89%，IC50為（21.5±0.43）μg/mL；而CUR-Micelles組對C6細胞的存活率隨著姜黃素濃度的升高而下降，其IC50為（1.95±0.12）μg/mL，明顯低于CUR solution組，差異有統計學意義（t=8.46，P＜0.05），見圖5A。據報道包裹在聚合物納米膠束中藥物，一般是以內吞機制進入細胞，因而使得藥物更有效的作用在細胞內，殺傷腫瘤細胞[3]。這一假設從細胞攝取結果中得到進一步確證。

在CUR濃度為2 μg/mL時，C6細胞與CUR solution和CUR-Micelles孵育1 h和4 h后，細胞攝取結果表明CUR solution組不管是在1 h還是4 h，細胞內的熒光都明顯比CUR-Micelles組低；除此之外CUR-Micelles組熒光甚至分布在細胞核內，細胞核DAPI熒光也可以發現CUR-Micelles組的細胞核有很多明顯的皺縮[6]。見圖5B。以上兩個方面也解釋了CUR-Micelles殺傷作用顯著的原因。

圖5 ε-PLL-UNA、CUR solution和CUR-Micelles對C6細胞的毒性（A）和C6細胞對不同制劑的攝取結果（B，×200）

3.6 腫瘤球生長抑制 近年來有研究發現腫瘤組織的無限增殖與自我更新可能與腫瘤組織內部的腫瘤干細胞有關，研究報道細胞成球培養能使腫瘤干細胞富集[7]。姜黃素被報道具有腫瘤干細胞抑制作用[8]。因此我們進一步構建了3D膠質瘤細胞球，以空白對照組和CUR solution組對比，體外考察了CUR-Micelles組對腫瘤球生長的抑制作用。結果表明，相比CUR solution，CUR-Micelles培育3 d后，與0 d對比，腫瘤球體積顯著下降，差異有統計學意義（t=6.74，P＜0.05），見圖6，表明納米膠束制劑能夠有效地增加姜黃素對腫瘤干細胞的殺傷作用，其具體機制可能與增加藥物的穿透有關[9]。

圖6 空白對照組、CUR solution組和CUR-Micelles組處理3 d后，膠質瘤細胞球的顯微圖（A，×200）和腫瘤球體積大小（B）比較

4 結論

本研究利用十一烯酸為疏水基，聚賴氨酸為親水骨架構建一個新型接枝聚合物ε-PLL-UNA，實現對疏水性姜黃素裝載，初步探索其對C6腦膠質瘤細胞的抑制效果。結果表明該接枝聚合物膠束實現對姜黃素具有一定的載藥量和包封率。載藥納米膠束能顯著延緩藥物的釋放，延長藥物作用時間。藥物攝取實驗表明，該聚合物膠束有效促進姜黃素被C6細胞攝取，甚至能深入到細胞核，有效殺傷腫瘤細胞。體外腫瘤球實驗也表明這種新型膠束能有效地抑制C6腫瘤細胞球的生長。為了進一步確定該載藥納米膠束對動物模型的效果，接下來需要進行體內藥動學以及藥效學的研究。

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（本文編輯：賈建敏）

Preparation and in vitro antitumor evaluation of curcumin-loaded micelles

FAN Ziliang, JIN Binghui,XU Xiafang, JIANG Qiaoying, XU Helin. School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University,Wenzhou, 325035

R94

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.001

2017-03-10

國家自然科學基金青年基金資助項目（81603036）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2016KYA136）；浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2017R413059）。

范子梁（1994-），男，安徽合肥人，碩士生。

徐荷林，碩士生導師，Email：xhlpharm1214@126.com。