不同等級山藥種栽與其內源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之間相關性研究△

張巖榮，董誠明，薛南南，任龍飛,劉丹

(河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008)

·中藥農業·

不同等級山藥種栽與其內源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之間相關性研究△

張巖榮，董誠明*，薛南南，任龍飛,劉丹

(河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008)

目的：由于山藥在種植過程中缺乏種栽標準，造成山藥的產量與質量穩定性差，本文主要通過研究不同等級山藥種栽中內源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量的差異，以及內源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量與各級種苗相關性，為建立山藥種栽標準提供依據。方法：根據藥用山藥種栽的長度、直徑、重量、芽數、凈度、飽滿度等形態學指標，運用SPSS Statistics 17.0分析軟件進行K-均值聚類分析，對山藥種栽進行分級，并對不同等級山藥種栽內源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性之間相關性進行分析。結果：制定了山藥種栽的等級劃分標準：一級：長度：≥26.8 cm、直徑：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽數：≥3.0、凈度：100%、飽滿度：100%；二級：長度：≥22.5 cm、直徑：≥2.10 cm、重量：≥36.0g、芽數：≥2.0、凈度：100%、飽滿度：100%；三級：長度：≥18.3 cm、直徑：≥1.80 cm、重量：≥20.0 g、芽數：≥1、凈度：≥99.0%、飽滿度：≥99.0%；山藥種栽中內源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性與各級種苗之間存在相關性。結論：不同等級的山藥種栽中生理指標的差異，為藥用山藥的規范化種植提供了理論和實踐依據。

藥用山藥；種栽；等級；內源激素；酶活性

山藥為薯蕷科多年生纏繞草本植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，始載于神農本草經，被列為上品，其性平，味甘，歸脾、胃、腎經，功能補脾養胃、生津益胃、補腎澀精[1]。為河南省著名道地藥材——四大懷藥之一，自夏、商時期起就有栽培山藥的歷史，到了明清以來逐漸形成道地藥材。河南焦作地區的溫縣、博愛、武陟、沁陽等地是我國正品山藥的道地和主要產區，這里出產的山藥特稱“懷山藥”，品質優良，久負盛名。

農戶在山藥種植方面大多依靠傳統的經驗，加上國家尚未有相關的山藥質量評價方法，結果造成在山藥生產過程中沒有標準可依。目前，山藥種栽大致可以分為三種：山藥蘆頭、山藥塊莖、零余子。山藥蘆頭又稱“山藥栽子”，是山藥塊莖的較細的先端，有一個隱芽和莖的斑痕，通常被用來做種栽；山藥塊莖也稱山藥段子，將山藥塊莖按8～10 cm分切成段；山藥零余子是用上年選育貯藏的山藥零余子繁育后做成的種栽。這就造成了山藥種栽混亂、質量好壞參差不齊，結果造成農戶生產的山藥有效成分含量不達標，產量也受到很大的影響，嚴重降低了山藥種植戶的經濟效益。為此，結合實際山藥種植過程中存在的問題，我們開展了對藥用山藥種栽標準的研究[2]。

植物內源激素調控著植物的生長、發育與分化，其中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量、蔗糖酶活性與山藥的生長發育有著密切的聯系，朱海旺等[3]研究了長山藥塊莖在休眠期的內源激素的含量變化，結果發現在山藥的不同休眠期，內源激素有較大的變化趨勢，為此，本實驗測定了不同等級種栽中內源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶含量的變化，來研究不同等級的藥用山藥中內源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性是否存在較大差異，來進一步驗證山藥種栽分級劃分的合理性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

河南焦作溫縣收集的藥用山藥種栽蘆頭，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 山藥種栽的形態學測定 長度 用量程為50 cm的直尺測量取樣藥用山藥種栽的長度，精確到0.1 cm。

重量 用電子天平，稱量取樣山藥種栽的重量，精確到0.1 g。

圍徑 用數顯游標卡尺準確量出每根山藥種栽最粗處的圍徑，精確到0.001 cm。

芽數 記錄各山藥種栽頂端的芽數。

凈度 除去山藥種栽中的霉變的、損傷的、雜質、泥土、砂石、土塊等重量后的比例。

飽滿度 外在飽滿、無損傷的、健壯的山藥種栽稱為飽滿的種栽，其占全部供試樣品的比例。

飽滿度=飽滿種栽數/供試樣品數

1.2.2 山藥種栽的分級 利用SPSS Statistics 17.0分析軟件，對藥用山藥種栽的形態學指標進行相關性分析，確定優先指標及順序，然后進行K-中心聚類分析[4]，將山藥種栽分為三級。

1.2.3 山藥種栽中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量的測定 稱取頂端山藥種栽1.0 g(精密到0.000 1 g)，用剪刀剪碎，置于液氮中速凍，然后再用2 mL 80%甲醇溶液(內含1 mmol·L-12，6-二叔丁基對甲酚；BHT)研磨成漿，4 ℃冰箱中提取4 h，4000 r·min-1離心15 min，沉淀用80%甲醇溶液重復提取3次，每次1 h，合并上清液，上清液用氮氣吹干儀吹干，然后用樣品稀釋液(0.01 mmol·L-1pH 7.2 PBS磷酸鹽緩沖液)溶解定容至5 mL容量瓶中[5-6]，最后用酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)測定。

具體操作步驟如下：1)在板孔上與待測樣品與相對應的位置上作好標記；2)手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板3次即可；3)在板孔上設置標準品孔和樣本品孔并各加不同濃度的標準品溶液50 μL；4)樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加；5)除空白孔外，標準品孔和樣本品孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；6)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此重復5次即可；7)每孔加入終止液50 μL，15 min內，用酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。

1.2.4 蔗糖酶活性的測定

1.2.4.1 酶的提取 取不同等級的藥用山藥1.0 g，精密稱定，用剪刀迅速剪碎，然后用預冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100 mL，在冰箱中浸提3 h，4000 r·min-1離心15 min，上清液即為酶的粗提液。

1.2.4.2 酶活性的測定 用移液管移取2 mL酶的粗提液，置于20 mL帶刻度的試管中，再加入5 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖液及1 mL 10%蔗糖溶液，在37 ℃水浴鍋中保溫0.5 h，取出后立即按3，5-二硝基水楊酸法[7]測定還原糖的含量。以煮沸酶液10 min鈍化酶的試管作對照。

1.2.4.3 還原糖標準曲線的制作及還原糖含量的測定

1)制作標準曲線：取6支20 mL帶刻度的試管，編號，按下表配置不同濃度的葡萄糖標準液：

管號123456葡萄糖原液量/mL00.40.81.21.62.0加蒸餾水量/mL2.01.61.20.80.40葡萄糖濃度/μg·mL-10100.0200.0300.0400.0500.0

在上述6支試管中分別加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加蒸餾水定容至20 mL，混勻，以1號管為空白，測540 nm波長下的A值。以A值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2)酶反應液中還原糖含量的測定：吸取2 mL酶反應液，加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20 mL，測定540 nm處的A值。查標準曲線得酶反應液中還原糖的濃度。

3)結果計算

轉化酶的活性用還原糖量表示，計算公式如下：

其中，U表示轉化酶的活性，mg·g-1·fw-1·h-1；

N表示酶反應液中還原糖的濃度，μg·mL-1；

N′表示鈍化酶反應液中還原糖的濃度，μg·mL-1；

V表示酶反應液的總體積；

T表示反應時間；

W表示材料鮮重。

2 結果與分析

2.1 藥用山藥種栽的形態學指標測定

材料為從河南焦作溫縣不同鄉鎮收集的藥用山藥種栽，測量6個形態學指標(長度、重量、直徑、芽數、凈度、飽滿度)。

表1 藥用山藥種栽的形態學指標測定

2.2 山藥種栽的分級

用SPSS Statistics 17.0分析軟件，對藥用山藥種栽形態學指標進行相關性分析，然后再進行K-中心聚類分析，將藥用山藥種栽分為三級，得到藥用山藥種栽的質量分級標準。

表2 藥用山藥種栽質量分級指標的相關性分析

注：**表示在0.01水平上極顯著相關；*表示在0.05水平上顯著相關。

在對藥用山藥種栽進行分級之前，我們測定了6個形態學指標(長度、直徑、重量、芽數、凈度、飽滿度)，結合實際生產經驗將芽數作為主要分級指標，由上述的SPSS Statistics 17.0相關性分析可以確定分級指標的優先順序，因為芽數與長度、直徑、重量顯著相關，而與凈度、飽滿度無相關性。因此，確定芽數、長度、直徑、重量作為主要分級依據，凈度和飽滿度作為參考依據；質量分級指標如表3所示。

由表3可知，確定了山藥種栽的等級劃分標準，由于芽數與長度、直徑、重量顯著相關，所以如果若芽數、長度、直徑、重量這4個指標有一項不達標則降一級。

表3 藥用山藥種栽質量分級標準

2.3 等級與種栽內源激素(IAA、GA3)含量的相關性研究

2.3.1吲哚乙酸(IAA)含量測定結果

2.3.1.1 IAA標準曲線結果 由實驗數據得IAA標準曲線方程為Y=0.029 6X-0.015 2(r=0.999 7)，其中X為IAA標準品的濃度；Y為IAA標準品溶液在450 nm波長處的A值。

2.3.1.2 不同等級的藥用山藥種栽中IAA含量比較結果 用酶聯免疫吸附法(ELISA)，結果如表4所示。

表4 不同等級藥用山藥種栽IAA含量

圖1 不同等級藥用山藥種栽中IAA含量

由表4、圖1可以看出，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定不同等級的藥用山藥種栽中IAA含量，結果表明不同等級之間IAA含量存在差異，一級最高為0.445 μg·g-1，二級次之為0.430 μg·g-1，三級最低為0.211 μg·g-1，由此可以說明種栽等級與IAA含量之間存在相關性關系。

2.3.2 赤霉素(GA3)含量測定結果

2.3.2.1 GA3標準曲線結果 由實驗數據得GA3標準曲線方程為Y=0.0141X+0.0319(r=0.996 4)；，其中X為GA3標準品的濃度；Y為GA3標準品溶液在450 nm波長處的A值。

2.3.2.2 不同等級藥用山藥種栽GA3含量比較結果 用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定，結果如表5。

表5 不同等級藥用山藥種栽GA3含量比較

圖2 不同等級藥用山藥種栽GA3含量

由表5、圖2可以看出，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定不同等級的藥用山藥種栽中GA3含量，結果表明不同等級之間GA3含量存在差異，一級最多為0.196 mg·g-1，二級次之為0.182 mg·g-1，三級最少為0.153 mg·g-1，由此可以說明山藥種栽與GA3含量存在相關性關系。

2.4 等級與種栽蔗糖酶酶活性的相關性研究

2.4.1 蔗糖酶標準曲線結果 由實驗數據得到蔗糖酶標準曲線方程為Y=0.0021X-0.998 9(r=0.997 8)；其中X為葡萄糖濃度，Y為葡萄糖溶液在540 nm波長處的A值。

2.4.2 不同等級藥用山藥種栽蔗糖酶(AI)活性比較結果 不同等級的藥用山藥種栽蔗糖酶含量測定結果如表6所示。

由表6、圖3可以看出，不同等級種栽中蔗糖酶活性存在差異，一級最大為0.320 5 mg·g-1fw-1h-1，二級次之為0.096 6 mg·g-1fw-1h-1，三級最小為0.086 4 mg·g-1fw-1h-1。蔗糖酶與植物組織的生長有密切關系，是衡量同化產物的轉化和利用，是植物細胞代謝及生長強度的指標[4]。表6、圖3得出的結果表明種栽等級可能與蔗糖酶活性之間存在相關性關系，即等級高的種栽，蔗糖酶活性大，生長代謝也可能也就越旺盛。

表6 不同等級藥用山藥種栽蔗糖酶活性結果

圖3 不同等級藥用山藥種栽中蔗糖酶活性結果

3 討論

品質優良的中藥材種子種苗是保證中藥材質量的首要因素，也是中藥材規范化種植所面臨的最嚴重的問題之一，我國中藥材種子種苗尚未形成獨立產業，處于一種自產自銷的生產狀態。150種栽培藥材除人參、甘草、黃芪、三七外均沒有相關的種子種苗國家質量標準[7]。本文結合中藥材生產的實際情況及中藥材種苗質量標準研究的實踐[8-11]，研究了河南省焦作溫縣地區的藥用山藥種栽其長度、直徑、重量、芽數、凈度、飽滿度與等級之間的相關性，探討了與藥用山藥生長發育過程相關的內源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性與等級的相關性研究，制定了藥用山藥種栽分級標準，進而指導藥用山藥的規范化種植，提高山藥實際生產的產量及質量。

4 結論

從實驗結果可以看到，藥用山藥種栽形態學指標、IAA、GA3、蔗糖酶活性等方面與等級都存在著非常顯著的相關性關系，這就要求我們在分級的操作過程中不僅要注重種栽形態學指標，更要從生理學指標對其分級結果進行驗證。基于本實驗，我們初步制定了藥用山藥種栽的分級標準：一級：長度：≥26.8 cm、直徑：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽數：≥3.0、凈度：100%、飽滿度：100%；二級：長度：≥22.5 cm、直徑：≥2.10 cm、重量：≥36.0 g、芽數：≥2.0、凈度：100%、飽滿度：100%；三級：長度：≥18.3 cm、直徑：≥1.80 cm、重量：≥20.0g、芽數：≥1.0、凈度：≥99.0%、飽滿度：≥99.0%。等級與山藥的生長發育狀況成相關性，此外不同等級的藥用山藥種栽中IAA、GA3含量和蔗糖酶活性之間也存在相關性關系，即一級最高，二級次之，三級最低，結果表明，對藥用山藥種栽進行等級劃分十分有必要，不僅能夠規范農戶對山藥種栽的優選，更進一步對山藥種栽標準的建立具有重要意義。

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CultivationofDifferentGradeYamandCorrelationbetweenEndogenousHormone(IAA，GA3)ContentandInvertaseActivity

ZHANGYanrong，DONGChengming，XUENannan，RENLongfei，LIUDan

(HenanUniversityofChinesemedicine，Zhengzhou450008，China)

Objective：Due to the lack of yam cultivation standards，the problems of quality and stability have resulted in yam production.In this paper，the different grade of yam cultivation endogenous hormone (IAA，GA) and invertase content differences，and the content of endogenous hormones (IAA，GA) and sucrase and seedlings correlation at all levels were studied in order to provide the basis for establish of yam plant standards.Methods：According to morphological indexes such as length，diameter，weight，number of buds，clarity，fullness and other indicators，the yam cultivation was classified by using SPSS Statistics 17.0 software K-means clustering analysis. The correlation between yams grade and the content of endogenous phytohomones (IAA，GA3) invertase activity was explored.Results：We developed a standard classification of medicinal yam seedlings。Class 1：Length：≥26.8 cm，diameter：≥2.40 cm，Weight：≥51.0 g，buds：≥3，Clarity：100% fullness：100%；Class 2：length：≥22.5 cm，diameter：≥2.10 cm，weight：≥36.0 g，buds：≥2.0，clarity：100.0% fullness：100.0%；Class 3：length：≥18.3 cm，diameter：≥1.75 cm，weight：≥20.0 g，buds：≥1 clarity：≥99.0%，plumpness：≥99.0%.There existed a correlation between endogenous hormones (IAA，GA3) content and all levels of seedlings.Conclusion：The medicinal yam of different grades has significant difference between physiological indexes，which provided a basis both in theory and in practice.

Medicinal yam；seedlings；grade；endogenous hormones；sucrase

2016-08-12)

國家中藥標準化項目(ZYBZH-Y-HEN-18);中央財政支持地方科技發展專項

*

董誠明，教授，研究方向：中藥資源學；Tel：(0371)65962581，E-mail：dcm371@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.017