UPLC-MS/MS法同時測定比格犬血漿中表兒茶素與4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素△

戴瑋，付淑軍，常新全，王鵬，郝彧，左臣強，石小娜,何新

[1.中國中藥公司，北京 100195；2.天津中醫藥大學 中藥學院，天津 300193；3.天津市創新藥物早期成藥性評價企業重點實驗室(籌)，天津 300457；4.瀚盟測試科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457]

·基礎研究·

UPLC-MS/MS法同時測定比格犬血漿中表兒茶素與4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素△

戴瑋1，付淑軍2，3，4，常新全1，王鵬3，4，5，郝彧2，左臣強5，石小娜4,何新2

[1.中國中藥公司，北京 100195；2.天津中醫藥大學 中藥學院，天津 300193；3.天津市創新藥物早期成藥性評價企業重點實驗室(籌)，天津 300457；4.瀚盟測試科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457]

目的：建立UPLC-MS/MS法同時測定比格犬血漿中表兒茶素(EC)與4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素(Cya-EC)的濃度，研究比格犬口服威麥寧膠囊后體內藥代動力學。方法：血漿樣品經鹽酸巰乙胺衍生化處理后，以乙腈-水(0.1%甲酸)為流動相梯度洗脫，Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.11 mm，1.7 μm)色譜柱分離，采用電噴霧電離源，以多反應監測方式進行正離子檢測，定量分析所用的離子反應分別為m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(內標：普萘洛爾)。結果：測定血漿中EC及Cya-EC的線性范圍均為10 ～ 2000 ng·mL-1，日內、日間精密度均小于14.82%，準確度均在±4.86%以內；使用DAS3.0藥代動力學軟件對血藥濃度數據進行處理，計算藥動學參數，EC及Cya-EC的主要藥動學參數t1/2分別為66.3和90.4 h，AUC0-∞分別為2 114.7和12 909.5 ng·h·mL-1。結論：本文建立的UPLC-MS/MS法運行時間短、選擇性強、靈敏度高、操作簡便、血漿用量少，適用于比格犬口服威麥寧膠囊后體內EC及Cya-EC的藥代動力學研究。

表兒茶素；4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素；超高效液相色譜-串聯質譜；比格犬血漿；威麥寧膠囊

威麥寧膠囊是由蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)多年生草本植物金蕎麥Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara中提取出的抗癌活性物質制成的原國家二類中藥新藥，具有活血化瘀、清熱解毒、祛邪扶正的功效，配合放、化療治療腫瘤有增效、減毒作用，單獨使用可用于不適宜放、化療的肺癌患者的治療，能夠改善晚期肺癌患者生活質量及免疫功能[1]等。威麥寧膠囊的有效成分威麥寧為縮合鞣質類化合物，該類化合物以黃烷-3-醇為結構單元通過碳-碳鍵聚合而成，其分子結構受黃烷-3-醇單元的類型、單元之間的連接方式、聚合單元數量、空間構型等因素的影響，差異較大。由于威麥寧組成結構復雜，目前尚無有效方法對威麥寧膠囊在生物體內的代謝情況進行表征評價。研究表明，威麥寧經巰乙胺硫解后，硫解產物分別為4β-(2-氨基乙硫基)兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素、兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯，其中主要為4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素，即表兒茶素為威麥寧最主要的結構單元[2]。本研究采用巰乙胺硫解法結合超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)，建立了同時測定比格犬口服威麥寧膠囊后血漿中的4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素和表兒茶素的分析方法，該方法操作簡便、快速、選擇性強，為威麥寧組分體內藥代動力學研究提供方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC-Quattro Premier XE 三重四級桿液質聯用儀，含Binary Solvent manager，Sample manager，Quattro Premier XE MS，Masslynx V4.1色譜工作站，ESI和APCI接口離子源；Qilinbeier旋渦混合器；Heraeus multifuge X3R高速冷凍離心機。

1.2 試劑

表兒茶素(Epicatechin，EC，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號：YA0402SC13)；4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素(Cya-EC，軍事醫學科學毒物藥物研究所，純度≥98%)；鹽酸普萘洛爾(Propranolol hydrochloride，Pro，購于美國Sigma Aldrich公司，純度≥99%，批號：16524AH)；威麥寧膠囊(北京華頤藥業有限公司，批號：130401)；鹽酸巰乙胺(美國Sigma Aldrich公司，純度≥98%，批號：MKBQ8406V)；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 動物

Beagle比格犬，體重9～10 kg，購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司。空白比格犬血漿由天津國際生物醫藥聯合研究院新藥毒理評價平臺提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及質譜條件

色譜柱：Waters BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A-水(含0.1%甲酸，V/V)，B-乙腈(含0.1%甲酸，V/V)梯度洗脫。梯度洗脫程序：0～1.0 min，95%～95% A；1.0～4.8 min，90%～84% A；4.8～6.3 min，84%～60% A；6.3～6.5 min，60%～5% A ；6.5～7.5 min，5%～5% A；7.5～7.51 min，5%～95% A ；7.51～10.0 min，95%～95% A。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：-3.2 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·h-1；錐孔氣流速：50 L·h-1；正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測(MRM)；EC、Cya-EC和Pro的錐孔電壓(Cone)分別為：22、15、35 V；碰撞能量(Collision)分別為：16、10、18 V；用于定量分析的離子反應分別為m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(Pro)，見圖1。

注：A.EC；B.Cya-EC；C.普萘洛爾。圖1 EC、Cya-EC和普萘洛爾[M+H]+的產物離子掃描質譜圖

2.2 樣品來源

選取健康Beagle比格犬8只(雄性)，體重(9±1.0) kg，實驗前1天禁食12 h以上，不禁水，給予威麥寧膠囊8粒(每粒含威麥寧200 mg)。實驗前抽取空白血，給藥后分別于0、10、20、30 min及1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84 h共16個時間點取前肢靜脈血1 mL，置于含肝素的離心管中，冰浴中放置，4 ℃下于0.5 h內3000 r·min-1離心10 min收集上層血漿，-80℃冰凍保存待測。

2.3 血漿樣品處理

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 方法的專屬性 分別取6只比格犬的空白血漿50 μL，除不加內標外，其余按2.3項下操作，進樣5 μL，得空白樣品色譜圖2A；將一定濃度的EC標準溶液、Cya-EC標準溶液和內標普萘洛爾溶液加入空白血漿中，依同法操作，得相應色譜圖2B；將一定濃度的威麥寧提取物溶液和內標普萘洛爾溶液加入空白血漿中，依同法操作，得相應色譜圖2C；取比格犬給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得相應色譜圖2D。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾EC、Cya-EC和內標普萘洛爾的測定。

3.1.2 標準曲線和定量下限 取空白血漿50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合標準系列溶液10L，配制成相當于血漿濃度為10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1的血漿樣品，按2.3項下操作，取5 μL進樣，進行LC-MS/MS分析，記錄色譜圖；以待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線。典型的回歸方程分別為：EC，Y=0.002 65X-0.006 21，r=0.990；Cya-EC，Y=0.001 79X+0.003 41，r=0.997。測定EC和Cya-EC的線性范圍均為10 ～ 2000 ng·mL-1。

取空白血漿50 μL，配制成相當于EC和Cya-EC血漿濃度均為10 ng·mL-1的樣品，將其進行6個樣本分析，并根據當日標準曲線計算每一樣本測定濃度，求得該濃度下EC和Cya-EC的日內精密度(RSD)分別為12.0%和7.5%；準確度(RE)分別為-3.8%和-4.6%。該結果表明LC-MS/MS法測定血漿中EC和Cya-EC的定量下限均可達10 ng·mL-1。

3.1.4 回收率與基質效應考察 取空白血漿50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合QC溶液10L，配制成相當于血漿濃度為20、200、1600 ng·mL-1的QC樣品，每個濃度3個樣本，進行LC-MS/MS分析，得到峰面積A。另取空白血漿50L，置1.5 mL 塑料EP管中，50L鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60 ℃水浴20 min，待反應結束后，加入50L甲醇，渦流混勻，離心10 min(15 000 r·min-1，4℃)，取上清液50L加入EC和Cya-EC的混合標準溶液3.3L、內標溶液6.7L和60L甲醇-水(50∶50，V/V)，配制成相應濃度，渦流混合，取5L進行LC-MS/MS分析，獲得相應峰面積B。再另取50L超純水，加入10L標準溶液、20L內標和50L鹽酸巰乙胺溶液，加入50L甲醇，渦流混勻后，取上清液50L并用50L甲醇-水(50∶50，V/V)稀釋后制備低、中、高3個濃度的無血漿基質樣品，取5L進行LC-MS/MS分析，獲得相應峰面積C。以峰面積A與峰面積B進行比較來評價EC、Cya-EC與內標回收率(R)，計算公式為R=A/B×100%；以峰面積B與峰面積C進行比較來評價EC、Cya-EC與內標基質效應(M)，計算公式為M=B/C×100%。

注：A.空白血漿；B.空白血漿中加入EC、Cya-EC(20 ng·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；C.空白血漿中加入威麥寧提取物(20 g·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；D.受試動物服用威麥寧膠囊后2 h的血漿樣品圖2 測定血漿中Cya-EC、EC和內標普萘洛爾的典型MRM色譜圖

EC低、中、高3個濃度的提取回收率分別為(97.5±6.6)%、(94.4±8.3)% 、(89.5±6.7)%，Cya-EC低、中、高3個濃度的提取回收率分別為(83.8±7.3)%、(82.5±4.4)%、(88.5±2.4)%。EC、Cya-EC和內標基質效應和回收率結果見表2。

表1 EC、Cya-EC在比格犬血漿中方法學考察的準確度、精密度(n=6)

表2 EC、Cya-EC在比格犬血漿中方法學考察的基質效應和回收率

3.1.5 穩定性考察

3.1.5.1 室溫放置2 h穩定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標準系列溶液10L，配制成相當于血漿濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，樣品室溫放置2 h后，依據2.4項下方法制備樣品，室溫放置2 h，每個濃度進行3個樣本分析，測定樣品質譜響應，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質譜響應進行比較。結果表明所有室溫放置2 h試驗測定值與添加值的相對偏差RE在5.3% 之內。即血漿樣品可以在室溫放置2 h，保障了整個分析過程中的數據真實、可靠。

3.1.5.2 3次冷凍、解凍循環穩定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標準系列溶液10L，配制成相當于血漿濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，經反復3次-80 ℃冰凍，室溫溶解后，依據2.4項下方法制備穩定性樣品，每個濃度進行3個樣本分析，測定樣品質譜響應，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質譜響應進行比較。結果表明所有3次凍融試驗測定值與添加值的相對偏差RE在15%之內。即血漿樣品可以進行反復3次凍融，保障了整個分析過程中的數據真實、可靠。

3.1.5.3 長期穩定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標準系列溶液10L，配制成相當于血漿質量濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，-80 ℃冰凍放置兩個月后，依據2.4項下方法制備穩定性樣品，每個濃度進行3個樣本分析，測定樣品質譜響應，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質譜響應進行比較。結果顯示，所有長期穩定性試驗測定值與添加值的相對偏差RE在12.3% 之內，表明長期冰凍放置血漿樣品，不影響本方法對樣品濃度進行準確測定。

3.1.5.4 處理后樣品4 ℃放置24 h穩定性考察 取空白血漿50L，按3.1.2項下操作，制備低、中、高3個濃度的QC樣品(每濃度3個樣本)，4 ℃放置24 h后進行穩定性考察，結果顯示測定值與添加值的相對偏差RE在15%之內，說明分析測試過程中的樣品穩定。

3.2 藥代動力學數據

3.2.1 藥時曲線 比格犬口服威麥寧膠囊后，根據EC和Cya-EC的血藥濃度及計算得到的表兒茶素總血藥濃度繪制藥時曲線。EC、Cya-EC及表兒茶素總濃度的血藥濃度-時間曲線分別見圖3、4。

圖3 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素及表兒茶素巰代物血藥濃度-時間曲線(n=6)

圖4 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素總血藥濃度-時間曲線(n=6)

3.2.2 藥動學參數 根據血漿-藥物濃度數據，采用生物利用度研究數據處理通用程序(DAS3.0.2)計算藥代動力學參數，采用梯形法計算AUC0-t值，以半對數作圖法，由消除相的末端4個濃度點計算t1/2，Tmax和Cmax采用實測值，所得表兒茶素、表兒茶素巰代物及表兒茶素總量的藥代動力學參數見表3。

4 討論

威麥寧是以中藥金蕎麥中提取得到的鞣質部位為原料制成的中成藥制劑，其主要活性成分是縮合鞣質。目前有關鞣質的研究多是針對其結構、含量測定方法和生物活性等方面[3]，對其在動物體內吸收、代謝的研究甚少。程小桂等[4-5]采用HPLC測定了原花青素B2和表兒茶素的含量，并采用同位素標記法研究了原花青素B2在大鼠體內的藥代動力學；亦有報道涉及血漿中表兒茶素和兒茶素的含量測定[6-8]。但威麥寧的活性成分縮合鞣質是一類聚合物，無法按常規方法對其體內行為進行定量研究，所以本研究借鑒了劉剛等[2]報道的鹽酸巰乙胺硫解法對威麥寧進行降解，對降解產物的主要成分表兒茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素在體內的代謝情況進行初步的研究。

表3 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素及表兒茶素總量的藥代動力學參數

本研究采用巰乙胺硫解法結合超高效液相色譜串聯質譜法，首次建立了同時測定比格犬口服威麥寧膠囊后，血漿中的表兒茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素的分析方法。在采用鹽酸巰乙胺硫解的過程中，對鹽酸巰乙胺加入體積、濃度及硫解反應溫度、時間進行了考察，最后確定采用50L鹽酸巰乙胺溶液(50 mg·mL-1)、60 ℃水浴20 min的效果最好。在UPLC液相條件優化過程中流動相采用乙腈-水(含0.1%甲酸)，比使用純甲醇和乙腈分離效果好，進一步采用梯度洗脫優化分離效果并使峰形良好。因鹽酸巰乙胺溶液配制采用濃鹽酸-甲醇(1∶9)，酸性較強，對血漿中的蛋白沉淀也有一定作用，故采用了蛋白沉淀的方法對血漿樣品進行前處理，簡單易行。

在穩定性的考察試驗中，給藥后的血漿需經過鹽酸巰乙胺硫解才能得到4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素，而血漿穩定性考察的是比格犬給藥后待測組分在血漿中的穩定性，故只能加入威麥寧提取物，以模擬真實的血漿去考察待測物在血漿中的穩定性。

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SimultaneousDeterminationofEpicatechinand4β-2(aminoethylthio)EpicatechininDogPlasmabyUPLC-MS/MS

DAIWei1，FUShujun，CHANGXinquan1，WANGPeng3，4，5，HAOYu2，ZUOChenqiang5，SHIXiaona4，HEXin2

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorpo.，Beijing100195，China；2.FacultyofChineseMateriaMedica,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tainjin300193，China；3.TianjinKeyLaboratoryofearlydrugevaluationofinnovativedrugs，Tianjin300457，China；4.HarmoniaTestandTechnology(Tianjin)Co.，Ltd.，Tianjin300457，China；5.TianjinInternationalJointAcademyofBiomedicine，Tianjin300457，China)

Objective：To establish a sensitive and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method to simultaneously determinate epicatechin(EC)and 4β-2(aminoethylthio)epicatechin(Cya-EC)in plasma of beagle dogs after oral administration of WeiMaiNing capsule.Method：Chromatographic separation was achieved on an Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)using a step gradient program with the mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile with 0.1% formic acid，at a flow-rate of 0.30 mLmin-1.Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in the positive ion mode.Multiple reaction monitoring mode with the transitions ofm/z291.1138.9(EC)，m/z366.1288.9(Cya-EC)andm/z260.2116.3(IS，propranolol)was performed to quantify，respectively.Results：The linear concentration ranges of calibration curves for EC and Cya-EC were 10-2000 ng·mL-1.The inter- or intra-day precision(RSD)was less than 14.82%，and the accuracy(RE)was within±4.86%.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.0.Thet1/2of EC and Cya-EC were 66.3 and 90.4 h.And the AUC0-∞of EC and Cya-EC were 2 114.7 and 12 909.5 ng·h·mL-1in beagle dog plasma after oral administration of WeiMaiNing capsules.Conclusion：The method was sensitive，rapid，convenient，using less plasma and was proved to be suitable for preclinical pharmacokinetic studies of EC and Cya-EC in beagle dog after oral administration of Wei MaiNing capsules.

Epicatechin；4β-2(aminoethylthio)epicatechin；UPLC-MS/MS；dog plasma

2016-06-30)

中國醫藥集團新產品開發基金(2011ZY01)

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付淑軍，工程師，研究方向：藥物代謝與藥物動力學；Tel：(022)65378888，E-mail：fushujun90@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.015