稀土元素鑭與丹參毛狀根中活性成分及其生物合成中關鍵酶的量效關系△

邊麗華，鄒琳，周冰謙，劉偉，周潔，3*，王曉

(1.山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；3.濟南大學 生物科學與技術學院，山東 濟南 250012)

·中藥農業·

稀土元素鑭與丹參毛狀根中活性成分及其生物合成中關鍵酶的量效關系△

邊麗華1，2，鄒琳1，周冰謙1，劉偉1，周潔1，3*，王曉1

(1.山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；3.濟南大學 生物科學與技術學院，山東 濟南 250012)

目的：研究稀土元素鑭與丹參毛狀根中活性物質及其生物合成中關鍵酶基因表達的量效關系，結合Hormesis效應理論探討鑭調控丹參次生代謝產物的閾值，以期為丹參中次生代謝產物調控及鑭肥的開發提供依據。方法：采用HPLC法測定丹參毛狀根活性成分含量，采用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，采用Takara反轉錄試劑盒合成cDNA，采用PCR熒光定量試劑盒進行實時定量檢測，采用SPSS軟件進行數據分析。結果：鑭處理對丹參活性成分積累及關鍵酶基因表達量影響顯著，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B表現出低濃度促進高濃度抑制的“拋物線”趨勢；AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五個關鍵酶基因表達量同樣表現出低促高抑的“拋物線”趨勢，該趨勢符合Hormesis理論曲線。結論：根據Hormesis理論分析，鑭對丹參的促進濃度閾值上限在0.1～1.0 mmol·L-1之間。

丹參；鑭；量效關系；Hormesis效應

土壤因子是影響中藥材產量和品質的重要因素[1]，稀土是重要的土壤因子之一，由原子序數為57-71的鑭系元素以及與之性質極為相似的鈧、釔共17種元素組成，適宜濃度的稀土處理會對植物產生積極的生理學效應[2]。中國是世界上稀土最豐富的國家，將稀土農用居于世界先進水平[3]，而稀土在中藥農業上的應用尚未得到深入探討。丹參源于唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根和根莖[4]，為我國常用大宗藥材，具有活血祛瘀、通經止痛等功效，是臨床上治療心腦血管疾病的要藥之一[5]。山東是丹參的道地產區和主產區，山東丹參道地產區土壤中稀土元素鑭含量較高，達到27 mg·kg-1[6]，丹參中鑭含量超過2 mg·kg-1[7]，推測鑭是影響丹參中活性成分積累的重要因子，有望將稀土引入丹參藥材生產中活性成分的調控。本文以丹參毛狀根作為材料，研究不同濃度鑭處理后丹參中活性成分積累及其生物合成途徑中關鍵酶基因表達的變化，探討鑭與丹參活性成分及其生物合成中關鍵酶基因表達之間的量效關系，以期為丹參活性成分的調控及鑭肥的開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參毛狀根由發根農桿菌菌株Agrobacteriumrhizogenes15834處理丹參葉片獲得，將經PCR鑒定的陽性株系置于6～7V液體培養基[8]中培養。精確稱取0.5 g毛狀根接種于50 mL培養基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培養。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理 毛狀根繼代培養18 d后，在無菌條件下添加LaCl3，使其終濃度達到0、0.01、0.1、1.0 mmol·L-1，等量滅菌水作為對照，每個處理6個重復，于處理后15 d取樣，取樣時將毛狀根取出后迅速吸干水分，每個取樣點所取樣品分為兩份，一份樣品用液氮迅速冷凍，置-70℃超低溫冰箱保存，用于基因表達分析；另一份樣品迅速超低溫冷凍干燥，用于丹參活性物質含量測定。

1.2.2 毛狀根中活性成分含量測定 將丹參毛狀根干燥后研磨過篩，用70%乙醇提取，采用HPLC法同時測定丹參毛狀根中的迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量[9-12]。以乙腈(A)-0.2%乙酸水(B)為流動相進行梯度洗脫：0～25 min，5%～35% A；25～26 min，35%～100% A。酚酸類成分檢測波長為270 nm，丹參酮類成分檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃。

1.2.3 毛狀根中活性成分生物合成中關鍵酶基因表達分析

1.2.3.1 毛狀根總RNA提取 采用TIANGEN RNA prep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性，采用核酸蛋白分析儀(TY10 Biospec-nano ZX21)檢測RNA濃度。

1.2.3.2 實時熒光定量PCR 采用TaKaRa試劑盒進行反轉錄，采用瓊脂糖凝膠法檢測cDNA采用實時熒光定量PCR儀進行PCR檢測，引物序列如表1所示。利用Pfaffi法計算目的基因和內參基因的擴增效率。計算公式為基因表達量=C(A-E)/D(F-B)，C為目的基因擴增效率；D為內參基因的擴增效率；A是對照樣品中目的基因的Ct 值；E是待測樣品中目的基因的Ct值；F是對照樣品重內參基因的Ct值；B是待測樣品中內參基因的Ct值。

表1 基因引物及其序列

1.2.4 數據分析 用Excel軟件處理數據，用SPSS 17.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 RNA提取與檢測結果

瓊脂糖凝膠電泳點樣孔無亮斑說明RNA無蛋白質污染，電泳呈現3條清晰條帶，其中28S和18S條帶亮度比值接近2，說明RNA完整無降解，符合反轉錄成cDNA的要求。核酸蛋白分析檢測結果顯示O260/230、O260/280讀數均在1.8～2.1之間，RNA濃度均在200 ng·μL-1以上，符合反轉錄成cDNA要求。cDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且為單一條帶說明PCR產物特異性好，無明顯引物二聚體，符合Real Time實驗要求。引物的特異性良好，各引物擴增效率均在適宜范圍之內，符合Real Time PCR實驗要求。

2.2 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中活性成分積累的影響

2.2.1 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響 如圖1所示，不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響大致表現為“拋物線”型和“凹線”型。二氫丹參酮和隱丹參酮含量表現出“凹線”型變化趨勢，0.01 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1的LaCl3處理后二氫丹參酮含量較對照分別升高26.18%(P<0.05)、31.52%(P<0.05)和111.07%(P<0.05)，隱丹參酮含量相對于對照分別升高25.03%(P<0.05)、26.40%(P<0.05)和372.30%(P<0.05)。隨著LaCl3濃度的增加，二氫丹參酮和隱丹參酮積累量不斷增加。不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量表現為“拋物線”型影響，0.01、0.1和1.0 mmol·L-1的LaCl3處理后，丹參酮Ⅰ含量分別為對照的124.84%(P<0.05)、93.69%(P<0.05)和79.16%(P<0.05)，丹參酮ⅡA含量分別為對照的200.63%、167.67%和124.37%(P>0.05)。

圖1 LaCl3處理對丹參酮類成分的影響

2.2.2 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中酚酸類成分積累的影響 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中酚酸類成分積累的影響如圖2所示。低濃度LaCl3對迷迭香酸和丹酚酸B的積累起促進作用，而高濃度處理抑制其含量的增加。LaCl3處理后迷迭香酸含量分別為對照的128.95%(0.01 mmol·L-1，P<0.05)、98.15%(0.1 mmol·L-1，P<0.05)和66.01%(1.0 mmol·L-1，P<0.05)；LaCl3處理后丹酚酸B含量分別為對照的148.04%(0.01 mmol·L-1，P<0.05)、123.75%(0.1 mmol·L-1，P<0.05)和82.75%(1.0 mmol·L-1，P<0.05)。

2.3 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中活性成分生物合成中關鍵酶基因表達的影響

2.3.1 不同濃度LaCl3處理對丹參酮類生物合成中關鍵酶基因的影響 由圖3可見，0.01 mmol·L-1LaCl3處理后AACT基因表達量顯著升高，約為對照的3倍；0.1 mmol·L-1LaCl3處理亦使AACT表達量高于對照，但相對于0.01 mmol·L-1LaCl3處理組有所下降；1.0 mmol·L-1LaCl3處理同樣提高AACT表達量，但相對于低、中濃度處理組表達量降低。可見，不同濃度LaCl3處理對AACT基因的表達表現出低濃度促進，而隨著處理濃度的升高，促進作用逐漸減弱的“拋物線”趨勢。不同濃度LaCl3處理對FPPS表達量均起到促進作用，但處理濃度和促進作用之間未表現明顯規律。0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1的LaCl3處理對GPPS基因的表達表現出抑制作用，1 mmol·L-1LaCl3處理對GPPS表達量表現出促進作用。

圖2 LaCl3處理對酚酸類成分的影響

圖3 LaCl3處理對丹參酮類成分代謝途徑中關鍵酶的影響

2.3.2 不同濃度LaCl3處理對酚酸類生物合成中關鍵酶基因的影響 由圖4可見，LaCl3處理后PAL表達量受到抑制，不同濃度處理之間未見顯著性差異。C4H、4CL、TAT和HPPR四個關鍵酶基因在不同濃度LaCl3誘導下，基因表達量均出現先升高，到達峰值后降低的趨勢。其中C4H和4CL基因表達量最高點均出現在0.1 mmol·L-1，而TAT和HPPR基因表達量最高點均出現在0.01 mmol·L-1。除PAL外，C4H、4CL、TAT和HPPR四個關鍵酶基因表達量均呈現“拋物線”樣趨勢，拋物線頂點出現的濃度在0.01 mmol·L-1或0.1 mmol·L-1。

圖4 LaCl3處理對酚酸類成分代謝途徑中關鍵酶的影響

3 討論

丹參酮類和酚酸類成分被認為是丹參主要的活性成分，本實驗研究了不同濃度鑭處理后丹參酮類和酚酸類的積累及其生物合成途徑中關鍵酶基因表達量的動態變化。鑭處理對丹參次生代謝產物積累影響顯著，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B均表現出低濃度促進高濃度抑制的“拋物線”趨勢，“拋物線”型次生代謝產物積累峰值均出現在0.01 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1處理濃度。鑭處理對關鍵酶基因表達量表現出類似的“低促高抑”的效應，AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五個關鍵酶基因表達量與處理濃度之間的量效關系也表現出“拋物線”趨勢。這種趨勢與目前國際研究的熱點問題“Hormesis效應”相似，“Hormesis”效應即“毒物興奮效應”，是指當生物體受到刺激，在最初的抑制反應過后會出現一個補償反應，補償反應最終會超過控制行為而出現凈刺激效應。目前比較公認的Hormesis量效曲線有兩種形式—β型曲線和U型曲線，β型曲線表現為小劑量刺激大劑量抑制，U型曲線即存在一個最小效應濃度，高于或低于該效應濃度時均表現出效應增強。本研究中鑭處理對丹參活性成分及其生物合成途徑中關鍵酶基因的表達處理效應整體符合β型曲線特征(見圖5)。根據Hormesis理論，在一定的濃度閾值內，外源刺激對植物體的生命力表現出促進作用，超出這個濃度閾值后外源刺激對植物體生命力產生抑制甚至造成死亡。本實驗結果顯示，對次生代謝產物和關鍵酶基因的抑制作用多出現在鑭濃度為0.1～1.0 mmol·L-1時，可見鑭對丹參活性成分和關鍵酶基因表達的促進濃度閾值上限在0.1～1.0 mmol·L-1之間，具體閾值范圍仍需進一步實驗研究。

圖5 Hormesis量效曲線

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Dose-effectRelationshipBetweenLaandActiveConstituentandKeyEnzymesExpressionofSalviamiltiorrhizaHairyRoot

BianLihua1，2，ZouLin1，ZhouBingqian1，LiuWei1，ZhouJie1，3，WangXiao1

(1.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;3.UniversityofJinan,Jinan250000,China)

Objective：The effect of La on the accumulation of active constituent and key enzymes expression ofSalviamiltiorrhizahairy root were studied and furthermore signaling molecules mediating the synthesis of secondary metabolism was also definited in order to provide references for the reveal of synthesis mechanism of active constituent ofSalviamiltiorrhizahairy root inducing by La.Methods:The content of active constituents were detected by HPLC. RNA was extracted with RNA prep Pure RNA purification kit(TIANGEN).Results: The dose-effect relationship between La and active constituent and key enzymes expression ofSalviamiltiorrhizahairy root showed a parabolic trend. The trend was in line with Hormesis effect curve.Conclusion: According to the Hormesis theory, the concentration upper threshold of La to promoteSalviagrowth is between 0.1～1.0 mmol·L-1.

Salviamiltiorrhiza；La；dose-effect relationship；hormesis effect

2016-07-21)

國家自然科學基金(81303161，81673527)；山東省自然科學基金項目(ZR2013HQ037)；山東省科技發展計劃(2015GSF119021，2015GSF119026)；名貴中藥資源可持續利用能力建設項目(2060302-1601-19)

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周潔，副教授，研究方向：中藥資源與藥用植物次生代謝調控研究；E-mail：zhoujie8761@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.016