欖香烯脂質體結合超聲空化技術對裸鼠異位瘤的抑制作用及毒性評價

王建中，徐逸，劉鵬程，陳浩波

欖香烯脂質體結合超聲空化技術對裸鼠異位瘤的抑制作用及毒性評價

王建中1，徐逸2，劉鵬程1，陳浩波1

（1.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院 腫瘤內科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 藥劑科，浙江 溫州 325015）

目的：以欖香烯脂質體（EL）作為對照藥物，評價EL結合超聲空化技術在抗腫瘤療效及降低不良反應中的作用。方法：建立大鼠膠質瘤C6細胞裸鼠皮下腫瘤模型并通過尾靜脈注射方式給藥，EL（濃度為 5 mg/mL）給藥劑量為50 mg/kg（0.1 mL/10 g）。實驗分5組（n=7）：0.9%氯化鈉溶液（空白對照）組、欖香烯

脂質體（EL）組、欖香烯脂質體+超聲造影劑（EL+MB）組、欖香烯脂質體+超聲（EL+US）組、欖香烯脂質體+ 超聲造影劑+超聲（EL+MB+US）組，每隔2 d給藥1次，共給藥3次，檢測裸鼠腫瘤體積變化、腫瘤質量變化、體質量變化和血液白細胞數等指標，取腫瘤組織，HE染色觀察腫瘤組織形態學變化，TUNEL試劑盒檢測腫瘤細胞凋亡程度，觀察超聲造影劑聯合超聲對EL抗腫瘤的療效與血液學毒性的影響。結果：與EL組比，EL+MB+US組對腫瘤體積增長的抑制作用強（P＜0.05），裸鼠體質量變化小，腫瘤細胞凋亡程度增加，白細胞數降低量減小（P＜0.05）。結論：與EL相比，EL+MB+US可以更有效地發揮對腫瘤生長的抑制作用，提高裸鼠生存質量，降低血液學毒性，可以作為一個新的腫瘤藥物遞送系統進一步開發研究。

欖香烯脂質體；超聲；空化效應；藥效學

欖香烯（elemene）是以β-欖香烯為主要成分，并含有少量γ-和δ-欖香烯及其他萜類化合物[1]。欖香烯脂質體（elemene liposome，EL）（注射液、口服乳）由于具有一定的靶向性和緩釋性，提高了生物利用度，在一定程度上提高了欖香烯的安全性和治療效率，因此替代了最初的欖香烯普通注射劑型，可是仍然存在藥物用量大、注射液對靜脈刺激產生炎癥、口服生物利用度低等問題[2]。低頻（1 MHz） 超聲可有效發揮微泡（microbubbles，MB）的空化效應，超聲定位空化技術可促進腫瘤組織藥物吸收、提高靶向性及克服耐藥性[3-4]。本研究主要是建立裸鼠腫瘤模型，以EL為對照，評價EL結合超聲空化技術的體內抗腫瘤療效，同時初步評價其對裸鼠的不良反應。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、試劑和細胞株：EL為大連金港制藥有限公司產品，脂質MB由溫州醫科大學藥學院贈送，其他化學試劑均為分析純，購自美國Alfa Aesar公司。大鼠膠質瘤C6細胞株購于中國科學院上海細胞庫。細胞培養試劑及耗材購自美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器：超聲系統（Acuson Sequoia 512C，德國Siemens公司），血細胞分析儀CA 620（Medonic，瑞典Boule Medical AB公司），獨立送回風凈化籠具IVC（蘇州蘇杭器材科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膠質瘤C6細胞裸鼠模型的建立與分組：選取5周齡雄性裸鼠40只（北京維通利華實驗動物技術有限公司），動物使用許可證號：SCXK（京）2011-0012，于右側腋下位置、皮下注射方式注射大鼠膠質瘤C6細胞懸液0.2 mL（每mL細胞懸液含有大鼠膠質瘤C6細胞2×107個），無菌環境中飼養。隔天測量1次裸鼠瘤體積，腫瘤平均體積達到100 mm3以上時，選擇瘤體積在100 mm3左右的裸鼠35只作為實驗動物。分為5組，每組7只，35只裸鼠的瘤體積值輸入Excel表格中，由大到小順序排列，在表格中計算調整，使5組裸鼠瘤體積均值接近[5]。

1.2.2 處理方法：5組裸鼠通過尾靜脈注射方式給藥，EL給藥劑量50 mg/kg（EL中藥物濃度為5 mg/ mL）。每隔2 d給藥1次，共給藥3次，具體實驗分組設置及給藥方案見表1。

表1 實驗分組及給藥方案

1.2.3 腫瘤生長抑制評價：給藥后每隔1 d測量裸鼠的瘤體積，計算腫瘤的體積相對生長率，最后1次給藥后測定腫瘤最終體積，計算最終的腫瘤的體積

相對生長率，然后將瘤體從裸鼠體內剝離，稱重，計算腫瘤的瘤重相對生長率。腫瘤體積計算公式：V=（l1+l2）×（w1+w2）2/16，其中l1和l2分別表示腫瘤的2次長軸測定值，w1和w2分別表示腫瘤的2次短軸測定值。第n次給藥的腫瘤體積相對生長率=[（Vn- V初始）/（V′n-V′初始）]×100%，其中V和V′分別表示各實驗組和空白對照組的腫瘤體積測量值。腫瘤總體體積相對生長率=[（V最終-V初始）/（V′最終-V′初始）]× 100%，腫瘤總體重量相對生長率=（W最終/W′最終）× 100%，其中W最終和W′最終分別表示各實驗組和空白對照組最后1次給藥后的腫瘤重量測量值。

1.2.4 動物的生存狀況評價：以體質量相對增長率 作為動物生存狀況的評價指標，記錄給藥過程中裸 鼠的體質量變化，計算各組實驗前后體質量增長率， 體質量相對增長率=（W最終體質量/W′最終體質量）×100%，其 中W最終體質量和W′最終體質量分別表示各實驗組和空白對照組的裸鼠最終體質量測量值。

1.2.5 HE染色觀察移植瘤病理及TUNEL凋亡實驗：將備用的各組裸鼠移植瘤于體視顯微鏡下觀察，組織切成2 mm×2 mm左右小塊，放入4%甲醛中固定 24 h，經石蠟包埋后切片，厚度為5 μm，HE染色做常規病理檢查，觀察移植瘤組織壞死程度。TUNEL凋亡檢測：取各組裸鼠移植瘤石蠟切片，按照羅氏（Roche）公司TUNEL試劑盒操作方法，脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。

1.2.6 血液毒性初步評價：在處死動物前，眼眶取血，依據CA620血細胞計數儀操作說明及指南，每只裸鼠收集20 μL全血用于細胞計數，初步評估血液系統不良反應。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行檢驗分析。計量資料以形式表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C6腫瘤生長抑制實驗 動物接種后1周左右可 見明顯豆粒大小腫塊，2周以上瘤體積接近100 mm3， 腫瘤處皮膚與正常部位皮膚無差異，皮下腫瘤組織呈突出隆起的結節狀，質硬，邊緣清晰。瘤體處于腋下位置。

2.1.1 腫瘤體積相對生長率測定實驗：各實驗組相對于空白對照組每天的腫瘤體積相對生長率曲線見圖1，從第4天開始，除空白對照組外，各實驗組均能明顯地不同程度抑制腫瘤的體積增長；EL組、EL+MB組、EL+US組腫瘤體積相對生長率差異無統計學意義（P＞0.05），提示在對應超聲強度及MB存在下，對EL的抗腫瘤效果并沒有影響；EL+MB+US組對腫瘤的抑制作用要強于EL+MB組、EL+US組和EL組 （P＜0.05）。

圖1 給藥過程中各組腫瘤體積相對生長率曲線

2.1.2 腫瘤重量相對生長率測定實驗：與空白對照組比，各實驗組均能夠顯著抑制腫瘤的重量增長（P＜0.05）；EL+US組、EL+MB組與EL組比較，對腫瘤重量的抑制作用差異無統計學意義（P＞0.05）；EL+ MB+US組與EL組、EL+MB組、EL+US組比，對腫瘤重量的抑制作用顯著增強，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.2 動物生存狀況

2.2.1 動物活體外觀觀察：各實驗組和空白對照組接種大鼠膠質瘤C6細胞后，觀察瘤體的生長情況及腫瘤的生長對小鼠活動的影響發現，空白對照組腫瘤增長迅速，皮下腫瘤組織呈非常明顯的結節狀突起，瘤體積碩大，給小鼠的正常活動造成了嚴重影響。盡管小鼠總的體質量沒有下降，但是身體正常組織呈現一定程度的消瘦跡象。EL+MB+US組給藥后腫瘤生長較空白對照組緩慢，瘤體積較小，小鼠的正常活動基本沒有影響，但身體正常組織由于藥物的不良反應也呈現一定的消瘦跡象。

圖2 各組腫瘤重量相對生長率

2.2.2 小鼠的體質量測量與比較：在給藥結束后，對各組小鼠的體質量進行測量，發現除空白對照組體質量明顯增加外，各實驗組均出現了明顯的體質量下降（P＜0.05），EL組、EL+MB組、EL+US組之間差異無統計學意義（P＞0.05），EL+MB+US組與其他實驗組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組給藥前后體質量增長率

2.2.3 HE染色觀察移植瘤病理及TUNEL凋亡實驗：空白對照組由緊密堆積的腫瘤細胞組成，因腫瘤的快速生長導致一些腫瘤壞死區，各實驗組腫瘤組織凋亡率均高于空白對照組，腫瘤組織中均出現廣泛的核收縮和碎片，提示發生不同程度壞死，其中EL+ MB+US組壞死程度最高，EL組、EL+MB組和EL+US組也可見腫瘤壞死組織，但壞死面積小于EL+MB+US組，見圖4。TUNEL凋亡實驗結果同時驗證，與空白對照組相比，EL+MB+US組中腫瘤組織細胞凋亡率最高；EL組、EL+MB組和EL+US組腫瘤組織中腫瘤組織細胞凋亡率也明顯高于空白對照組，但凋亡程度此3組相差不大，見圖5。

2.2.4 血液系統不良反應初步評價：與空白對照組比，實驗組白細胞計數降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。EL+MB+US組與其他治療組比白細胞減少的程度均顯著減弱，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖6。

圖4 光鏡觀察動物模型腫瘤細胞的壞死程度（HE，×100）

圖5 TUNEL法觀察各組腫瘤細胞凋亡（×400）

3 討論

本研究通過建立裸鼠異位瘤模型，結合物理靶向（超聲空化）技術，觀察EL的療效與不良反應。在本課題組的前期研究中，已探索了作用于裸鼠的安全超聲參數，超聲頻率為14 MHz，超聲時間為 10 s，間隔1 s超聲3次[6]。前期體外細胞實驗研究顯示，EL+MB+US組體外仍保留較好的抗腫瘤細胞的活性，對大鼠膠質瘤C6細胞的半抑制濃度（IC50）為 130.5 μg/mL，低于EL的220.8 μg/mL。

由于機體的生理特征以及腫瘤的異質性，遞送系統從給藥到靶點發揮作用需要克服多重生理及病理屏障，包括血液腫瘤組織細胞和胞內轉運等屏 障[7]。對于腦部疾病治療，需要克服血腦屏障，因此挑戰更大。神經膠質瘤是顱內常見腫瘤，治療手段有限，預后極差[8]。近年來為克服藥物遞送屏障提出的很多新思路與新方法，為設計克服腫瘤生理病理屏障的遞送系統實現對藥物的有效遞送和腫瘤的高效安全治療也有很多理論和實踐參考，超聲空化技術因為其安全性和精準定位性得到研究者重視，近年來取得較多進展[10-11]。欖香烯本身存在非水溶性、穩定性差、生物利用度低等缺點，近些年科研工作者嘗試研制多種新型欖香烯制劑，以期開發出更多可以應用于臨床、安全性好、治療疾病類型廣、治療效率高的欖香烯新型制劑[2-3]。

本研究成功建立了人大鼠膠質瘤C6細胞皮下接種裸鼠腫瘤模型，通過裸鼠腫瘤體積變化、腫瘤重量變化、體質量變化和血液中白細胞數等指標的檢測，考察了EL+MB+US與EL在治療腫瘤中的差異，發現EL+MB+US相比單純EL可以提高治療效果，改善動物生存質量。

EL+MB+US對大鼠膠質瘤C6細胞接種的皮下腫瘤模型顯示了很強的腫瘤抑制作用，實驗過程中未觀察到明顯的EL相關不良反應。分析其原因推斷如下：首先，本研究選擇低強度超聲，單純超聲對于腫瘤細胞孔徑影響較小，不能促進EL進入腫瘤細胞，而MB在超聲作用下爆破，增強了空化效應，促進了EL進入腫瘤細胞；其次，MB中的所含成分泊洛沙姆本身也具有一定的生物效應[12]，具有一定的增敏作用，在腫瘤組織內部可在一定程度上抑制細胞外排泵的外排，這可能由于在MB爆破后體現出這種作用，單純MB發揮作用不明顯；此外，研究發現泊洛沙姆具有調節凋亡信號的能力[6]，進而促進腫瘤細胞的凋亡。總而言之，EL+MB+US可以有效地提高腫瘤的治療效率，超聲結合微泡對于腫瘤靶向治療具有研究意義。

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（本文編輯：趙翠翠）

Evaluation of the inhibitory action and toxicity of elemene liposome combining ultrasound cavitation on the ectopic tumor of the nude mice model

WANG Jianzhong1, XU Yi2, LIU Pengcheng1, CHEN Haobo1.
1.Department of Oncology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To evaluate the inhibitory action and toxicity of elemene liposome (EL) combining ultrasonic cavitation on the entopic tumor for the nude mice model. Methods: The inhibitory efficacy was studied using C6 cells bearing armpit tumor model. Mice were assigned to 5 groups (n=7) as follows: group 1 for saline, group 2 for EL, group 3 for EL+MB, group 4 for EL+US and group 5 for EL+MB+US. Mice were administered via tail vein at the dosage of 50 mg/kg amount to 0.1 mL/10 g (injection solution/mice weight), 1 time per 2 d, 3 times in all. Tumor volume, tumor weight change, body weight growth rate were all measued. The white blood cell count (WBC) at the end point was also tested. Results: Compared with EL, EL+MB+US showed higher tumor growth inhibition, fewer mice body weight change and white blood count change (P＜0.05) in the armpit tumor model. Conclusion: With better anti-tumor activity and lower blood toxicity, EL+MB+US may be developed as a new cancer targeted delivery system.

elemene liposome; ultrasound; cavitation effect; pharmacodynamics

R739.41

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.005

2016-09-15

浙江省中醫藥科技計劃項目（2014ZB112）。

王建中（1971-），男，浙江溫州人，主任醫師，碩士。