長鏈非編碼RNA AL049452在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

孫祥威，胡盈盈，徐劍峰，張良，毛晨晨，郭剛強，黃關立，沈賢，薛向陽

長鏈非編碼RNA AL049452在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

孫祥威1，胡盈盈2，徐劍峰1，張良1，毛晨晨1，郭剛強3，黃關立4，沈賢5，薛向陽3

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學 基礎醫學院 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035；4.溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤科，浙江 溫州 325015；5.溫州醫科大學附屬第二醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：探索長鏈非編碼RNA（lncRNA）AL049452在結直腸癌組織中的表達及臨床意義。方法：收集84例手術切除的結直腸癌及相應的癌旁正常組織，qRT-PCR檢測lncRNA-AL049452的表達水平，用Mann-Whitney U檢驗分析lncRNA-AL049452表達水平和結直腸癌患者臨床病理特征的關系，同時分析其對結直腸癌患者的總生存時間及無病生存時間的影響。繪制ROC曲線評價lncRNA-AL049452診斷結直腸癌的效能。結果：結直腸癌患者腫瘤組織lncRNA-AL049452的表達水平明顯高于癌旁正常組織（P=0.0035），腫瘤更大的結直腸癌患者其lncRNA-AL049452的表達量更高（P=0.024）。生存曲線分析顯示，高表達lncRNA-AL049452的結直腸癌患者的無病生存時間較低表達組更短（log-rank=4.208，P=0.034）。ROC曲線分析顯示，lncRNAAL049452診斷結直腸癌的曲線下面積為0.723（95%CI=0.613～0.832，P＜0.001），敏感性和特異性分別為86.0%和51.2%。結論：腫瘤組織中高表達的lncRNA-AL049452可能參與了結直腸癌發生發展進程，是結直腸癌診斷和預后判斷的新生物標記物。

長鏈非編碼RNA；AL049452；結直腸腫瘤；生物學標記

結直腸癌是全球發病率第三的惡性腫瘤，全球每年超過693 900例患者死于結直腸癌[1]。發病率位于中國惡性腫瘤第四位，并逐年上升，嚴重威脅公眾生命健康[2]。隨著基因組學的進展，人們發現結直腸癌的發生發展與原癌基因和抑癌基因的改變密切相關[3]。人類基因組中有98%的轉錄產物不編碼蛋白質，即非編碼RNA，其中長度大于200 nt的轉錄本被稱為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[4]。研究表明lncRNA通過表觀遺傳學調控、轉錄水平及轉錄后水平調控影響靶基因的表達，從而參與糖尿病、腫瘤等多種疾病的發生發展[5-6]。AL049452是G蛋白偶聯受體180基因（G protein

coupled receptor 180，GPR180）3’端長約577 bp的轉錄本，并不編碼任何蛋白質，是新的lncRNA。GPR180是近年來新發現的G蛋白偶聯受體家族的成員[7]，參與血管重建并與腫瘤預后相關[8-9]， 但lncRNA-AL049452在腫瘤中的表達及效應迄今尚未闡明。本研究旨在探索lncRNA-AL049452在結直腸癌中的表達及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 組織標本來源于2004年2月至2006年12月在溫州醫科大學附屬第一醫院進行手術并經病理確認的84例結直腸癌患者。其中男46例，女38例；年齡為37～81歲，中位年齡65歲。所有患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、脈管侵犯等均由溫州醫科大學附屬第一醫院病理科確認，其中腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、Duke分期根據2012美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結直腸癌臨床實踐指南劃分。切取結直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織（距離腫瘤＞10 cm），保存于液氮中。術后前2年每3個月隨訪1次，術后第3年以后每半年隨訪1次。總生存時間和無病生存時間均從術后第1天開始計算，總生存時間統計至患者死亡，無病生存時間統計至患者腫瘤復發或至死亡。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器：Trizol購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；realtime-PCR采用Step One PlusTM實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）系統；lncRNA-AL049452及GAPDH的引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，序列見表1。

表1 LncRNA-AL049452及GAPDH的qRT-PCR引物

1.2.2 生物信息學：GSE37364表達譜芯片信息來自NCBI GEO數據庫。該芯片含有38例結直腸正常組織，29例結直腸腺瘤，27例結直腸癌的表達譜數據。編輯R語言代碼從中提取AL049452的表達數據，進行統計分析。

1.2.3 RNA提取及反轉錄：切取30 mg的冰凍組織進行研磨，按照說明書用Trizol提取RNA，并用紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）檢測RNA的純度及濃度。取1 μg RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進行反轉錄，合成的cDNA在-20 ℃保存。

1.2.4 qRT-PCR：按照20 μL qRT-PCR體系：將1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，10 μL SYBR Mix，7 μL DEPC水依次加入八連管并混勻，按3 000 r/min離心1 min。采用Step One PlusTMqRT-PCR系統，反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s、72 ℃ 32 s循環40次。設置3個復孔，lncRNAAL049452及GAPDH的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。結果以GAPDH為內參進行校正，并按照結直腸癌組織/癌旁正常組織處理成2-△△CT的形式。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0統計學軟件進行統計學分析。lncRNA-AL049452的表達量以M（P25，P75）表示。結直腸癌、結直腸腺瘤及癌旁正常組織lncRNA-AL049452表達量的比較以及不同臨床病理學特征lncRNA-AL049452表達量的比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用ROC曲線分析lncRNAAL049452診斷結直腸癌的敏感性和特異性。生存曲線采用Kaplan-Meier分析，采用log-rank test進行統計檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 lncRNA-AL049452及GAPDH的qRT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

2 結果

2.1 LncRNA-AL049452在結直腸癌組織中的表達情況 GSE37364表達譜芯片分析顯示，lncRNA-AL049452 在癌旁正常組織[99.85（85.03，113.15）]、結直腸腺瘤[133.01（98.55，183.55）]及結直腸癌[204.45（167.12，284.35）]中的表達量逐漸升高（P＜0.001），見圖2。qRT-PCR結果顯示lncRNA-AL049452在腫瘤組織中的表達量[2.50（1.13，7.35）]明顯高于癌旁正常組織（P=0.0035）。

2.2 LncRNA-AL049452診斷結直腸癌的價值 ROC曲線分析結果顯示lncRNA-AL049452診斷結直腸癌的曲線下面積（area underthe curve，AUC）為0.723（95%CI=0.613～0.832，P＜0.001），診斷結直腸癌的敏感性和特異性分別為86.0%和51.2%，約登指數為0.372，有較高的診斷價值（見圖3）。

2.3 LncRNA-AL049452表達水平與結直腸癌患者臨床病理學特征的關系 如表2所示，lncRNA-AL049452 的過表達與結直腸癌的大小有關（P=0.024），而lncRNA-AL049452的表達量與患者的性別、年齡、腫瘤分化、浸潤、淋巴結轉移、TNM分期、Duke分期、脈管侵犯及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平無關（P＞0.05）。

圖2 LncRNA-AL049452在結直腸癌表達譜芯片GSE37364中的表達情況

圖3 LncRNA-AL049452診斷結直腸癌的ROC曲線

2.4 LncRNA-AL049452表達水平與結直腸癌患者預后的關系 以結直腸癌患者lncRNA-AL049452表達量的平均值為界，將結直腸癌患者劃分為lncRNAAL049452高表達組（38例）和低表達組（46例）進行生存分析。結果顯示lncRNA-AL049452不同表達組結直腸癌患者總生存率差異無統計學意義（logrank=0.099，P=0.753），但是lncRNA-AL049452低表達組的中位無病生存時間（disease-free survival， DFS）為43個月，明顯高于lncRNA-AL049452高表達組的30個月（log-rank=4.208，P=0.034），見圖4。

3 討論

lncRNA是長度大于200 nt的非編碼RNA，缺乏開放閱讀框，不編碼任何蛋白[10]。按lncRNA在基因組的位置，分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向 lncRNA、基因內lncRNA及基因間lncRNA[11]。lncRNA 起初被認為是“基因組噪音”，而后研究證實lncRNA通過表觀遺傳學、轉錄水平及轉錄后水平調控靶基因的表達，參與各種疾病的發生發展[12]。

表2 LncRNA-AL049452表達水平和結直腸癌臨床病理參數的關系[M（P25，P75）]

圖4 不同lncRNA-AL049452表達水平結直腸癌患者的生存曲線分析

遺傳物質改變是腫瘤發生發展的重要因素，原癌基因的激活及抑癌基因的失活都會最終促成腫瘤的發生[13]。研究證明，lncRNA與結直腸癌發生和發展密切相關。如lncRNA-CCAT2在結直腸癌中過表達，并且促進腫瘤細胞的增殖和轉移[14]，lncRNA loc285194作為p53的靶基因，可以抑制結直腸癌細胞的增殖[15]。同時lncRNA可以作為結直腸癌診斷和預后的潛在指標[16]。AL049452作為一個新的 lncRNA，位于GPR180的3’端；而GPR家族能夠調節腫瘤的血管重建，GRP180對腫瘤的發展有抑制作用。為分析lncRNA-AL049452在結直腸癌的表達，我們首先分析GEO數據庫中lncRNA-AL049452的表達，結果發現，lncRNA-AL049452在結直腸正常組織向腺瘤及癌的演進過程中表達量逐漸上升。進一步qRT-PCR檢測發現，與癌旁正常組織相比，lncRNA

AL049452在結直腸癌中表達明顯上調。已發現一些lncRNA可以作為結直腸癌診斷的潛在生物學指標，如HOTAIRM1作為腫瘤抑制因子對結直腸癌具有和CEA類似的診斷價值，其診斷效能優于CA19-9和CA125[17]。循環中的lncRNA-BCAR4、lncRNA-MAGEA、lncRNA-KRTP5可以聯合作為結直腸癌診斷的良好指標，其AUC可達0.857[18]。我們應用ROC曲線分析lncRNA-AL049452表達量對結直腸癌早期診斷的價值，發現AUC為0.723，敏感性和特異性分別為86.0% 和51.2%，約登指數為0.372，有較高的診斷價值。

研究證實lncRNA與結直腸癌的臨床特征及預后密切相關，如lncRNA-GAPLINC在結直腸癌中高表達，并與腫瘤大小、T分級、N分級有關，是結直腸癌不良預后的獨立危險因素[19]；過表達lncRNA-H19的結直腸癌患者，其腫瘤的分化程度更低，TNM分期更晚，總生存時間和無病生存時間更短[20]。臨床病理學分析發現，結直腸癌組織的AL049452表達量與結直腸癌的腫瘤大小有關。生存分析發現lncRNAAL049452低表達的結直腸癌患者，其無病生存時間長于高表達lncRNA-AL049452的患者。以上結果提示結直腸癌惡性程度越高，其lncRNA-AL049452表達量越高，同時患者的預后情況也越差，因此AL049452 在結直腸癌的發生發展中起著重要的作用。

綜上所述，lncRNA-AL049452在結直腸癌組織中高表達與腫瘤大小有關，而且對于結直腸癌的診斷及預后判斷均有提示作用。深入研究lncRNAAL049452參與結直腸癌發生發展的機制，對于結直腸癌的早期診斷、完善治療、改善預后均有一定價值。

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（本文編輯：賈建敏）

Expression of lncRNA-AL049452 in the tissue of colorectal cancer and its clinical significance

SUN Xiangwei1, HU Yingying2, XU Jianfeng1, ZHANG Liang1, MAO Chenchen1, GUO Gangqiang3, HUANG Guanli4, SHEN Xian5, XUE Xiangyang3.
1.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 3.Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 5.Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the expression and clinical significance of lncRNA-AL049452 in colorectal cancer (CRC). Mothods: Eighty-four cases of CRC tissues and corresponding paracancerous tissues were collected. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression level of lncRNA-AL049452 in these tissue specimens. Correlation between the expression of lncRNA-AL049452 and clinicopathological features was analysed by Mann-Whitney U test. Kaplan-Meier survival curves was used to analysed overall survival time and disease-free survival time between different lncRNA-AL049452 levels. Receiver operating characteristic (ROC) curve was performed to observe the diagnostic value of lncRNA-AL049452 for colorectal cancer. Results: lncRNA-AL049452 expression level in CRC tissues was obviously higher than that in corresponding paracancerous tissues (P=0.0035). High expression of lncRNA-AL049452 indicated larger tumor size (P=0.024). The lncRNA-AL049452 high-expression group presented significantly lower disease-free survival rates than the low-expression group (log-rank=4.208, P=0.034). In addition, ROC curves analyse showed that the AUC of ROC curve was 0.723 (95%CI=0.613-0.832, P＜0.001) with 86.0% sensitivity, 51.2% specificity. Conclusion: The highexpression of lncRNA-AL049452 in tumor tissues may play an important role in the progression in CRC, and can serve as novel biomarker for the diagnosis and prognosis of CRC.

long non-coding RNA; AL049452; colorectal neoplasms; biological markers

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.004

2016-07-31

國家自然科學基金資助項目（81472308，31470891）；溫州市科技計劃項目（20150050）。

孫祥威（1992-），男，浙江溫州人，碩士生。

薛向陽，副教授，Email：wzxxy001@163.com。