斜紋夜蛾嗅覺反應晝夜節律及其調控機制

林慧玥，錢凱，白家秀，張道根，魯瑞，萬新龍

斜紋夜蛾嗅覺反應晝夜節律及其調控機制

林慧玥，錢凱，白家秀，張道根，魯瑞，萬新龍

（溫州醫科大學 健康與環境生態研究所，浙江 溫州 325035）

目的：研究斜紋夜蛾嗅覺反應的晝夜節律和調控機制，為更有效的防治提供新的思路和方法。方法：通過測定多種寄主植物氣味化合物和性信息素在晝夜8個不同時間點下的斜紋夜蛾觸角電位（EAG）反應，發現斜紋夜蛾的EAG反應晝夜節律并篩選出斜紋夜蛾EAG反應最為強烈的化合物，進一步通過風洞技術測定黑暗期5個不同時間點斜紋夜蛾對這些化合物的行為反應，驗證其行為晝夜節律；同時通過RT-qPCR技術檢測多個調控晝夜節律的時鐘基因和嗅覺受體基因在晝夜各個不同時間點的表達水平差異。結果：斜紋夜蛾雄蟲對所有測試植物氣味化合物和性信息素的EAG反應都表現出雙峰模式，即都在黑暗之后3 h和9 h的反應最為強烈，并篩選出斜紋夜蛾最為敏感的5種化合物：Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc、石竹烯、芳樟醇和苯乙醛。斜紋夜蛾在黑暗期5個時間點對這5種化合物行為反應也表現出與EAG反應相類似的夜間節律。從 基因表達水平來看，大部分嗅覺受體基因和時鐘基因都在黑暗之后3 h和（或）9 h表達水平達到最高峰值。結論：斜紋夜蛾的嗅覺反應晝夜節律與嗅覺基因和時鐘基因表達的晝夜節律大體上是一致的，表明斜紋夜蛾的嗅覺反應節律可能都是由這些時鐘基因和嗅覺基因在其體內進行表達調控的。

斜紋夜蛾；晝夜節律；觸角電位；風洞；RT-qPCR

昆蟲經過長期的演化，它們的許多生命活動和行為形成了晝夜節律性。昆蟲的許多行為如取食、交配以及尋找棲息地等都是依靠嗅覺來完成的。因此，昆蟲的嗅覺反應也一定具有節律性的。目前對昆蟲嗅覺反應晝夜節律及其分子機制的研究報道較少。對隱花色素基因的研究表明，其在生物體內具有很高的同源性[1]，通過分子系統進化分析可以探索出各個物種間的親緣關系，因而該基因成為分子進化的又一個研究熱點。由于昆蟲生理活動與生物鐘現象密切相關，通過研究其節律機制能夠更深人了解蟲害的發生與發展規律[2-4]。

近年來晝夜節律的分子機制這個暗箱逐漸被打開。目前轉錄/翻譯反饋環被認為是主要的生物節律產生的分子基礎，并通過該環中產生的蛋白反饋抑制它們自身的轉錄。現研究最多、最深入的是果蠅的晝夜節律分子機制[5]。在果蠅，有五種被認為是晝夜節律反饋調節的必需基因：period（per）、 timeless（tim）、clock（clk）、cycle（cyc）和cryptochromes（cry）[6]。目前，昆蟲晝夜節律的研究主要聚焦在生物鐘水平。生物鐘是基于一組 “時鐘基因”的轉錄/翻譯反饋循環而產生的內源性晝夜節律性的周期變化[7]，研究發現2個時鐘基因per和cry1在甘草夜蛾和灰翅夜蛾的觸角中表達量呈晝夜周期性變化規律，表明這2種夜蛾的晝夜節律與其時鐘基因的時間表達水平有關[8]。生物鐘調節嗅覺反應已經在黑腹果蠅的觸角中發現[16]。觸角電位（electroantennogram，EAG）反應實驗表明，黑腹果蠅和蟑螂對其寄主植物氣味和性信息素的嗅覺反應也都表現出明顯的晝夜周期性變化[9-10]， 而敲除cry基因之后它們的觸角神經元則表現出了異常的嗅覺反應晝夜節律[9]。另外，研究發現敲除黑腹果蠅的中心振蕩器細胞對其EAG反應的晝夜節律沒有影響，而破壞其觸角神經元之后發現其EAG反應的晝夜節律消失[11]，表明觸角神經元足以調控嗅覺反應的晝夜節律。盡管觸角時鐘調節EAG反應節律的機制還不明確，但是基于微陣列的研究方法已經表明那些與氣味識別相關的基因，如嗅覺受體基因（olfactory receptors，OR）、氣味結合蛋白基因（odorant binding proteins，OBP）也起著時鐘調節作用[12]。除此之外，性信息素合成激活神經肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）、黑化誘導激素（corazonin，Crz）以及色素擴散因子（pigment dispersing factor，PDF）被認為參與和調節動物的晝夜節律行為，不同的時間點在昆蟲腦部結構中分布的位置和表達的水平不一樣[13]。

斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是我國長江以南蔬菜、煙草、棉花、茶葉、葡萄等農業和林特作物的重要害蟲，繁殖力強，且棲息地隱蔽，對農藥抗性強，藥劑防治非常困難，已到了無藥可用的地步[14]。 目前防治斜紋夜蛾主要依靠化學藥劑進行防治，但大量使用化學農藥導致斜紋夜蛾對多種殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性，防治效果減低[15]。近幾年關于植物氣味引誘雌成蟲產卵或增強性信息對雄蟲引誘效果的研究已經應運而生，并取得了相當不錯的成果。因此，利用植物氣味和性信息結合其行為節律，或許能為探索新型防治害蟲的方法提供理論基礎和思路。目前關于斜紋夜蛾嗅覺反應晝夜節律及其分子機制幾乎還沒有進行過系統地研究報道。為此，本研究選取斜紋夜蛾為研究對象，通過EAG反應、風洞以及RT-qPCR技術共同探索其嗅覺反應的晝夜節律及分子調控機制。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源 斜紋夜蛾蛹購買于河南濟源白云實業有限公司，并放置于溫州醫科大學健康與環境生態研究所人工智能氣候室內進行羽化，室內光照時間12 h:12 h，其中黑暗時間從人為授時時間（zeitgeber time，ZT）3到ZT15，光照時間從ZT15到ZT3；溫度（27±1）℃，濕度70%±10%。羽化成蟲飼以10%葡萄糖水作為補充營養。

1.2 植物氣味化合物和性信息素及其配制 供試揮發性氣味化合物的名稱、純度和來源見表1。用石蠟油作溶劑，分別將每種揮發性化合物配成濃度為0.01 μg/mL的溶液。

1.3 EAG反應的測定 為了研究斜紋夜蛾對上述供試化合物EAG反應的晝夜節律，我們分別在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24共8個時間點測定了斜紋夜蛾對每種化合物的EAG反應。每次測定前先將斜紋夜蛾觸角切除頂端，然后將觸角基部和頂端分別套在參考電極和記錄電極上。實驗采用Syntech EAG記錄系統記錄、分析其電位的變化。測定參照杜永均等[16]和方宇凌等[17]的方法，實驗中每次吸取20 μL配好的溶液均勻滴于6 cm× 0.5 cm的濾紙上，并移入滴管中，滴管末端連接氣體刺激控制裝置，頂端插入具有連續氣流的巴斯德管小孔中。經活性碳處理的干凈、濕潤的連續氣流的流量為1 200 mL/min，刺激氣流流量為40 mL/min， 對準斜紋夜蛾觸角刺激，每次刺激時間為0.1 s。以 液體石蠟油為對照。各種測定每根觸角只用1次，用完之后再用另一只斜紋夜蛾的觸角進行測定。每個時間段在刺激間隔為60 s的實驗條件下，分別重復5次，取其均值作為最終的EAG反應值。

表1 EAG反應中使用的氣味化合物名稱、分子量、純度及來源

1.4 風洞實驗 斜紋夜蛾對植物氣味和性信息素的行為反應的晝夜節律研究在風洞中進行。風洞裝置長200 cm，寬和高均為70 cm。風洞內設置溫度26 ℃，相對濕度為60%～75%。在實驗開始前，將孵化3 d的雄蟲單獨裝入玻璃管（10 cm×2.5 cm）中，并用紗布封住開口處。在距上風端20 cm、高35 cm的支架上放置滴有20 μL植物氣味化合物或性信息素化合物的濾紙條作為氣味源，濾紙每15 min換1次。同時在氣味源周邊設置1個直徑為10 cm左右的球形鋼絲網罩以保護誘芯不受雄蛾的污染和為雄蛾在誘芯附近降落提供場所。在距下風端120 cm處設置1個高30 cm的昆蟲釋放支架。實驗開始時，將裝有斜紋夜蛾雄蟲的玻璃管放置昆蟲支架上，拿掉紗布，開始觀察并記錄雄蛾在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12和ZT15這5個不同的時間點對氣味化合物的行為反應。每頭昆蟲任其反應3 min，如無行為反應則換下，引入另1頭雄蛾繼續實驗；實驗中每個處理重復3 次，每次重復測試20頭雄蛾。記錄下列行為反應的斜紋夜蛾數量：飛行、定向飛行和著陸。

1.5 斜紋夜蛾觸角基因表達量測定

1.5.1 總RNA提取：分別在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24時間剪取并收集斜紋夜蛾觸角，每組取20對觸角作為1個重復，每個時間點設置3個重復。每個重復的觸角收集完畢后立即用液氮研磨，采用Trizol法提取總RNA。提取的RNA溶于DEPC處理水后經瓊脂糖凝膠電泳及紫外-可見分光光度計測其260/280比值檢測RNA純度和濃度。

1.5.2 cDNA模板的合成：按照反轉錄實驗手冊使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。反應體系包括10 μL反應體系一：2 μL 5×gDNA Buffer、 1 μg RNA、RNase-Free ddH2O補足到10 μL；10 μL反應體系二：2 μL 10×Fast RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix、5 μL RNase-Free ddH2O。先將體系一于42 ℃孵育3 min后立即放置在冰上，然后將反應體系二全部加入反應體系一中；最后將混合反應體系42 ℃孵育15 min， 95 ℃孵育3 min，并4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃保存備用。以上所有樣品均設置3個生物學重復。

1.5.3 RT-qPCR：為探索斜紋夜蛾嗅覺反應晝夜節律的分子調控機制，本研究共測定了9個嗅覺受體基因（OR01、OR03、OR06、OR11、OR13、OR14、OR26、 OR27和OR83）和10個時鐘基因（clk1、clk2、cry1、cry2、cyc1、cyc2、per1、tim1、tim2和crz）在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24時間點的表達水平。用GAPDH作為參照基因。用做RT-qPCR的基因引物見表2。RT-qPCR在實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad）上完成，每個PCR反應體系為20 μL，包括10 μL Su-permix，1 μL正向引物（10 μmol/L）， 1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL滅菌蒸餾水。采用的qPCR擴增程序為：預變性95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，和70 ℃ 10 s 擴增40個循環。每個基因的相對表達水平采用CT值 法的相對定量法計算，以2-△△Ct計算基因的相對表達量，△△Ct=△Ct目的基因-△Ct參照基因；△Ct=Ct目的基因- Ct持家基因。

1.6 統計學處理方法 所有數據都利用Excel軟件制作成平滑曲線圖，分析比較斜紋夜蛾在不同時間點對不同植物氣味和性信息素化合物的EAG反應和行為反應，以及多個嗅覺受體基因和時鐘基因的表達水平差異。

表2 RT-qPCR引物序列

2 結果

2.1 斜紋夜蛾對植物氣味和性信息素化合物的EAG反應的晝夜節律 斜紋夜蛾的EAG反應表現出雙峰的晝夜節律模式，即斜紋夜蛾觸角對所有植物氣味和性信息素化合物的EAG反應都在黑暗后3 h和9 h表現最為強烈，且在黑暗期所有時間點的觸角EAG反應值要高于光照期所有時間點的EAG反應值（見圖1）。這個結果表明，斜紋夜蛾的生物活性在黑暗期要明顯強于光照期，這與絕大多數蛾類昆蟲所表現出的晝伏夜出的生活習性一致。另外，根據斜紋夜蛾對不同化合物的EAG反應值大小可以將這些化合物分為4組。第1組化合物包括斜紋夜蛾的性信息素主要成分Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc及斜紋夜蛾寄主植物成分石竹烯、芳樟醇和苯乙醛，斜紋夜蛾對這5種化合物的EAG反應最為強烈（見圖1A）；第2組化合物包括植物氣味化合物苯甲醛、己烯醛、1-辛烯-3-醇和乙酸，斜紋夜蛾對它們的EAG反應也較為強烈，但較第1組化合物稍弱（見圖1B）；第3組化合物包括植物氣味化合物α蒎烯、乙酸葉醇酯、壬醛和壬醇，斜紋夜蛾對這4種化合物的EAG反應又比第2組化合物更弱一些（見圖1C）；第4組化合物則包括斜紋夜蛾性信息素化合物的一些衍生化合物Z9-14:OAc、Z9-12:OAc、E11-14:OAc、Z11-16:OAc和Z9-14:OH，斜紋夜蛾對這些化合物的EAG反應最弱（見圖1D）。

2.2 斜紋夜蛾行為反應的晝夜節律 本研究通過風洞裝置測定了黑暗期所有時間點（光照期斜紋夜蛾活動較弱，根本不起飛，因此無法測定其行為反應）斜紋夜蛾對其EAG反應最為強烈的5種化合物（Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc、石竹烯、芳樟醇和苯乙醛）的行為反應。結果表明，斜紋夜蛾對這5種化合物的起飛、定向飛行（芳樟醇除外）以及著陸（芳樟醇和石竹烯除外）行為反應都表現出與EAG反應一致的雙峰模式，即在黑暗后3 h和9 h其3種行為反應最為強烈（見圖2）。從斜紋夜蛾對這5種化合物的飛行反應來看，表現最弱的時間點為剛進入黑暗期的時候（ZT3），產生飛行反應的斜紋夜蛾百分比只有10%（Z9E12-14:OAc）到20%（苯乙醛）；表現最為強烈的時間點為ZT6和ZT12，在這2個時間點，斜紋夜蛾的飛行比例最高分別達到50%（ZT6）和55%（ZT12）（見圖2）。定向飛行反應的斜紋夜蛾百分比總體要比飛行反應的低，在0到20%之間。除芳樟醇外，所有的化合物吸引斜紋夜蛾定向飛行的高峰期都在黑暗之后3 h和9 h這2個時間點（ZT6和ZT12），最高百分比分別達到20%（苯乙醛）和15%（苯乙醛）；而斜紋夜蛾對這4種化合物的定向飛行反應最弱的時間點都在黑暗之后6 h（ZT9），在這個時間點，斜紋夜蛾定向飛行的比例只有0（石竹烯）和7.5%（Z9E11-14:OAc）。與這4種化合物不同，斜紋夜蛾對芳樟醇的定向飛行反應+只有在黑暗后9 h（ZT12）表現最為強烈（為7.5%），而在剛進入黑暗期時（ZT3） 表現最弱（為0）（見圖2）。從著陸反應來看，斜紋夜蛾對所有化合物的著陸反應偏弱，最高的著陸斜紋夜蛾百分比僅為5%。其中斜紋夜蛾對Z9E12-14:OAc、 Z9E11-14:OAc和苯乙醛的著陸率高峰期都在黑暗之后3 h和9 h這2個時間點（ZT6和ZT12），最高百分比均達到5%（Z9E11-14:OAc和苯乙醛）；而斜紋夜蛾對芳樟醇和石竹烯的著陸率高峰期只出現在黑暗之后9 h（ZT12），最高百分比均為2.5%（見圖2）。

圖1 不同時間點斜紋夜蛾對植物氣味和性信息素化合物的EAG反應

總體而言，5種化合物對斜紋夜蛾引導的飛行、定向飛行及著陸等行為具有一定的節律性，均在黑暗后3 h（ZT6）和（或）9 h（ZT12）出現高峰期，而在剛進入黑暗期（ZT3）或者黑暗6 h（ZT9）表現最弱，這規律與EAG反應的實驗結果一致。

2.3 斜紋夜蛾基因表達水平的晝夜節律 為了進一步探討斜紋夜蛾在EAG反應和風洞實驗中所表現出來的嗅覺反應晝夜節律的調控機制，本研究在不同時間點檢測了斜紋夜蛾多個嗅覺受體基因和時鐘基因的表達水平，結果發現所有嗅覺受體基因（OR01、OR03、OR06、OR11、OR13、OR14、OR26、OR27和OR83）表達水平規律與斜紋夜蛾嗅覺反應的晝夜節律一致，均在黑暗后3 h（ZT6）和9 h（ZT12）表達達到最高水平，而且這些基因在黑暗期的表達水平整體上要高于光照期的表達水平（見圖3A-B）。光照期除OR14在光照3 h后又出現了1個表達小高峰之外，其他嗅覺受體基因表達水平都很低，而且波動不大（見圖3A）。與嗅覺受體基因不一樣，時鐘基因的表達水平規律不一致，但總的來說，所有基因表達水平在黑暗期要比在光照期高（見圖3C-D）。其中per1、crz、cry1和cry2這4個時鐘基因的表達水平規律與嗅覺受體基因一樣，都在黑暗后3 h （ZT6）和9 h（ZT12）表達水平達到最高值；cyc2則在黑暗后3 h（ZT6）和12 h（ZT15）這2個時間點表達水平達到最高值；其他所有時鐘基因（tim1、tim2、cyc1、clk1和clk2）都只在黑暗后3 h（ZT6）這1個時間點表現出表達高峰，其他時間點表達水平差異不大（圖3C-D）。

3 討論

動物的晝夜節律是一種復雜的生物學現象，是動物對各種環境條件變化（如光照、溫度、濕度等非生物條件和食物條件、種內社群關系和種間關系等生物因素）的綜合適應[18]。對于地球上的絕大多數生命有機體來說，光線是它們調整生物鐘的主要因素，通過對光線的感受從而調整它們的生理時鐘與自然界光照變化保持一致[19]。本研究通過EAG反應和行為反應（風洞實驗）發現斜紋夜蛾的嗅覺反應是具有一定的晝夜節律性，這與其嗅覺基因和時鐘基因表達水平的晝夜節律基本上一致。

圖2 黑暗期不同時間點斜紋夜蛾對3種植物氣味化合物和2種性信息素化合物的行為反應

昆蟲主要是靠觸角上的嗅感器來感受氣味的，有氣味的化學刺激物質在嗅感器內轉變成電信號，通過觸角上的神經傳向中樞[20]。在快速檢測觸角對氣味的反應活性和敏感性方面，EAG反應是一種非常重要的生物測定方法。它具有很高的敏感性和選擇性，因此被廣泛地應用于昆蟲嗅覺研究中[21]，成為昆蟲信息素及其它揮發性信息化合物生物測定非常得力的方法之一[22]。風洞實驗國內運用的不多，與嗅覺儀相比，風洞實驗能更好地模擬田間條件，可觀察的指標較多，而且靈敏度也很高，其研究的對象為飛行的成蟲。風洞實驗從斜紋夜蛾的行為上有力地驗證了嗅覺反應是具有一定的晝夜規律的。風洞實驗選取的化學刺激物均為從EAG反應中篩選出的，斜紋夜蛾敏感的化合物，因此實驗結果更直觀強烈地證明嗅覺反應具有較強的晝夜規律。不同化合物在不同時間對斜紋夜蛾引導的行為也是不一樣的，從側面可以求證出嗅覺反應最強的時間段，從而為化學信息素誘捕斜紋夜蛾打下了基礎。目前國內研究嗅覺行為大多是以嗅覺儀為主，通過風洞實驗來研究斜紋夜蛾的晝夜節律較少。本研究則運用EAG反應和風洞實驗來檢測斜紋夜蛾在不同時間段受到氣味刺激后所產生的電生理和行為反應變化，并通過熒光定量PCR檢測其嗅覺受體和時鐘基因表達水平的晝夜節律以揭示其嗅覺反應晝夜節律的調控機制，進一步了解斜紋夜蛾的生物學特性，從而為該昆蟲的防治提供重要的理論依據。

本研究中EAG反應和風洞實驗表明，斜紋夜蛾在黑暗后3 h和9 h的嗅覺最為活躍，而且在黑暗期的嗅覺反應總體上要比在光照期的嗅覺反應更為靈敏，這與絕大多數的蛾類昆蟲的生物行為晝夜節律一致。除此之外，蛾類生物行為晝夜節律還表現在其化蛹、羽化、交配、產卵、孵化等方面[23]。 蛾類昆蟲大多數產卵是在交尾后第2天的夜間，如棉 大卷葉夜蛾（S.derogate）、沙棘木蠹蛾（H.hippophaecolus）和甜菜夜蛾（S.exigua）的產卵時間都是在交尾后第2天晚上，其產卵時間分別為夜間20：00- 22：00，20：30-22：00和00：00-5：00[24-26]。在其他 昆蟲中，其生物行為也是有一定晝夜節律的。如井上蛀果斑螟蟲羽化、產卵、交配、化蛹等行為的高峰期都分別在18：00-4：00、2：00-10：00、4：00- 8：00、10：00-14：00和18：00-22：00，表現出較明顯的晝夜節律[27]。

昆蟲行為節律被認為是一種由生物鐘基因控制的內源性節律[28]。這種行為節律在其他夜行性動物中也充分存在，并被指出與嗅覺傳入有一定關聯，認為嗅覺傳入會影響晝夜節律，這兩者的關聯性已被證明[29]。目前關于斜紋夜蛾的晝夜節律分子機制的研究較少，我們猜測斜紋夜蛾嗅覺反應的晝夜節律也是通過時鐘基因來控制的，故我們檢測了不同時間點的斜紋夜蛾的時鐘基因以及編碼嗅覺反應的嗅覺受體基因的表達水平。從時鐘基因和嗅覺基因表達水平的實驗結果來看，這兩種基因的表達隨時間變化均具有較強的節律性，但各個基因的節律性并不相同，這也許是它們功能的側重點不同。有研究表明在果蠅中有100多個基因有較強的晝夜節律，分別參與了嗅覺、視覺、攝食等反應[30]。本研究中，斜紋夜蛾的時鐘基因表達水平出現一定的節律性，其基因整體的表達水平在黑暗期較光照期高，這與斜紋夜蛾活動習性相一致。時鐘基因在黑暗期的高水平表達有利于增加活動相關酶的量及活性，為斜紋夜蛾夜間活動本身條件提供便利。cyc1和clk2不管在黑暗期還是光照期，其基因表達水平起伏不大，但仍不排除它輔助或負反饋其他基因表達的作用。嗅覺基因表達規律性更強，各基因高表達水平均時間段位于黑暗后3 h和9 h，在光照期的基因表達水平均較低，與斜紋夜蛾活動習性相一致。斜紋夜蛾主要在夜間活動及覓食，嗅覺基因在此時間段高水平表達進而合成嗅覺相關蛋白為夜間覓食做準備。OR14在光照期3 h出現了峰值，我們推測OR14基因在白晝交替的時間段作用較大，而光照對其表達影響不顯著。

圖3 不同時間點斜紋夜蛾幾個嗅覺受體基因和時鐘基因的表達水平

本研究運用EAG反應和風洞實驗，運用植物揮發物及性信息素在1 d內的不同時間段對斜紋夜蛾的嗅覺反應活性進行檢測，了解植物揮發物及性信息素對斜紋夜蛾雄蟲的電生理反應及行為反應，找出斜紋夜蛾對這些刺激氣味的晝夜節律性，為進一步提高斜紋夜蛾誘集效率提供科學依據。通過研究斜紋夜蛾時鐘基因和嗅覺受體基因表達水平的晝夜節律，為進一步深入探索斜紋夜蛾以及其他蛾類昆蟲晝夜節律的調控打下堅實的理論基礎，后期可以結合更多行為學觀察進而為害蟲的防治提供更寬廣的思路。當然，斜紋夜蛾觸角嗅覺反應的晝夜節律還可能和光強度[31]、溫度[32]、地理性[33]等因素有關，有待進一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Study on circadian rhythms of olfactory response and its regulatory mechanisms in Spodoptera litura

LIN Huiyue, QIAN Kai, BAI Jiaxiu, ZHANG Daogen, LU Rui, WAN Xinlong.
Institute of Health and Environmental Ecology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To study circadian rhythms of olfactory response and its regulatory mechanisms in Spodoptera litura, providing new insight in controlling this pest. Methods: Electroantennogram (EAG) was used to determine the electrophysiological responses of S. litura to chemicals originated from sex pheromones and host plants at eight different time points during day, finding the circadian rhythms of EAG responses in S. litura and selecting out the compounds to which the moths strongly responded. Then the wind tunnel was used to measure the behavioral responses of S. litura to these compounds at the same five time points during the scotophase. In addition, the expression levels of genes regulating circadian rhythms and olfaction at the same time points were detected by the real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) technique to reveal the molecular regulatory mechanism of olfactory circadian rhythms in S. litura. Results: The results showed that the strongest EAG responses of male S. litura to all tested plant odor compounds and sex pheromone components occurred after 3 hours and 9 hours in the dark, showing a bimodal pattern. A total of five compounds: Z9E12-14:OAc, Z9E11-14:OAc, caryophyllene, linalool and phenylacetaldehyde were selected and tested in behavioral responses (wind tunnel). The behavioral responses of S. litura to the five chemicals at five time points during scotophase showed similar patterns to that obtained from the EAG tests. The expression levels of the most olfactory receptor and clock genes reached the peak after 3 and 9 hours in the dark, which is largely consistent with the circadian rhythms of olfactory responses in S. litura. Conclusion: The circadian rhythms of olfactory responses were consistent with those of expression levels of olfactory and clock genes in S. litura, suggesting that the circadian rhythms are probably essentially regulated by clock and olfactory genes.

Spodoptera litura; circadian rhythms; electroantennogram; wind tunnel; RT-qPCR

Q965

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.002

2016-11-02

浙江省自然科學基金資助項目（LY15C030003）；溫州醫科大學科研啟動基金（89213002）。

林慧玥（1991-），女，浙江瑞安人，碩士生。

萬新龍，副研究員，Email：smartw@wmu.edu.cn。