新型靶向納米探針在早期上尿路上皮癌動物模型中的 成像研究

廖國棟，王麗江，俞蔚文，張建設

·論 著·

新型靶向納米探針在早期上尿路上皮癌動物模型中的 成像研究

廖國棟1，王麗江2，俞蔚文1，張建設3

（1.浙江省人民醫院 泌尿外科，浙江 杭州 310014；2.浙江大學 浙江大學加州國際納米技術研究院， 浙江 杭州 310027；3.溫州醫科大學 基礎醫學院，浙江 溫州 325035）

目的：探討上轉換熒光材料（UCP）納米探針的熒光特征及其對早期上尿路上皮癌移植瘤的靶向性。方法：采用高溫裂解法先合成水溶性UCP，再制備靶向酸性組織插入多肽（pHLIP）偶聯的UCP納米探針，利用Maestro小動物活體多光譜影像系統（CRI）觀察pHLIP-UCP探針對荷瘤動物模型上尿路上皮腫瘤的成像。結果：合成了分散性好、粒徑小、溶液通透性高的NaYF4:Yb3+，Er3+上轉換納米晶體；UCP納米探針對荷瘤動物模型成像的上轉換發光信號在黑暗環境下發光穩定、靈敏度高。結論：體內UCP納米粒子能明顯富集在腫瘤組織，在早期上尿路上皮癌活體成像中有較大的應用潛力。

上尿路上皮癌；納米探針；上轉換成像；動物模型

上尿路上皮癌來源于腎盂、輸尿管的尿路上皮，大多數在診斷時已為浸潤性癌，導致手術效果不佳、總體預后較差[1]，術后有64.6%出現腫瘤進展，35.6%出現腫瘤轉移[2]。因此，上尿路上皮癌的早期診斷意義重大。目前，納米科技為腫瘤的早期探測提供了新的思路，基于納米粒子的早期腫瘤標志物檢測技術[3]、基于納米粒子光熱轉換效應基礎上的顯像治療一體化技術[4]、納米緩釋藥物與納米藥物遞送器件[5]等基于納米粒子的早期腫瘤標志物 檢測技術已取得了重大進展。本研究合成基于上轉 換熒光材料（up-converting phosphor，UCP）的納米 分子影像探針，對早期上尿路上皮癌進行了成像。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：三氯化鉺（ErCl3）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，三辛基氧化膦（trioctylphosphine oxide，TOPO，90%）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，CF3COOH）購自美國Sigma-Aldrich公司。正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）購自天津阿法埃莎化學有限公司，其他試劑購自上海生工生物工程有限公司。所有化學試劑均為分析純級別。

1.1.2 實驗動物：BALB/c小鼠，6～8周齡，SPF級，來源于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK（浙）2012-0178，由浙江大學實驗動物中心飼養。

1.2 方法

1.2．1 聚醚酰亞胺（polyetherimide，PEI）高分子包裹的水溶性UCP納米晶體制備：利用文獻[6]記錄的高溫裂解法制備PEI高分子包裹的水溶性UCP。所有稀土試劑均為5N（99.999%）純度。（CF3COO）3Er的制備需要提前將相應的稀土氧化物溶解在CF3COOH中，并在回流溫度下加熱。當溶解完全后，在真空條件下除去溶劑。所得的固體真空下室溫過夜，不需要進一步凈化。向已加入10 g TOPO的50 mL三口燒瓶中同時再加入1.25 mmoL CF3COONa、0.48 mmoL （CF3COO）3Y、0.12 mmoL（CF3COO）3Yb以及制備好的0.00024 mmoL（CF3COO）3Er前體。再將得到的反應混合物在100 ℃、真空下放置30 min，完成脫氣過程。再將該溶液在氬氣下迅速加熱到360 ℃，并保持在這個溫度1 h，同時大力磁力攪拌（1 000 r/min）。 接著溶液冷卻至室溫后，加入氯仿和甲醇沉淀納米 粒子。通過離心（轉速12 000 r/min，時間為15 min） 收集納米粒子，用乙醇洗滌3次。純化的納米粒子顆粒再分散在環己烷和儲存純化的納米顆粒再加入環己烷中分散和儲存（室溫）。通過動態光散射和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope， TEM）（JEOL/JEM-2010F）分析所制備UCP的粒徑，利用熒光光譜儀在外接980 nm光源下測定所制備粒子的發光光譜。

1.2.2 將靶向插入微酸組織多肽（pH low insertion peptide，pHLIP）與UCP連接：采用固相合成法合成的pHLIP序列如下：Ala-Cys-Glu-Gln-Asn-Pro-Ile-Tyr-Trp-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asp-Trp-Leu-Phe-Thr-Thr-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Asp-Glu-Gly-Thr-Gly。多肽與粒子間偶聯采用的linker是4-（N-馬來酰亞胺甲基）環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（SMCC）（美國Pierce 公司），用于連接多肽N末端的Cys巰基與粒子表面氨基。利用SMCC linker連接蛋白與納米粒子的方法是：將50 mg SMCC溶于5 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中配成10 mg/mL SMCC溶液，取純化好的高亮度UCP約0.015 mmol，分散于5 mL磷酸緩沖鹽溶液PBS中，將兩者迅速混合，37 ℃振蕩反應30 min，用PBS透析除去多余的SMCC，取1 mL 0.15 moL/L pHLIP多肽溶液與透析好的溶液混合，繼續37 ℃振蕩反應30 min。反應結束后，離心沉淀納米粒子并反復洗滌，于4 ℃保存。

1.2.3 利用pHLIP-UCP納米探針對早期上尿路上皮癌腫瘤模型進行高靈敏成像：建立裸鼠上尿路上皮 癌皮下荷瘤動物模型，在接種后第1天進行觀察，研 究pHLIP-UCP探針對早期腫瘤的顯像靈敏度和特異度。移植瘤模型的建立方法：在體外培養上尿路上皮癌細胞株T24，細胞計數，制備腫瘤細胞懸液，將制 備好的腫瘤細胞懸液吹打均勻，固定好動物，乙醇棉球消毒注射部位（下肢）的皮膚，按每只動物每個部位0.1 mL（約0.5×106個細胞），將連接完畢的pHLIP-UCP納米探針溶液按每只動物1 mL注射入腹腔，1 d后進行光學檢測。采用Maestro小動物活體多光譜影像系統，其光譜檢測范圍為400～950 nm。激發源是運行在980 nm和安全功率為0.2 W的紅外激光二極管[14]。使用電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）相機捕獲圖像，使用MaestroTMver 2.4軟件包分析所得到的影像，通過熒光強度判定探針對上尿路上皮癌腫瘤細胞的富集程度和靈敏度。

2 結果

2.1 TEM分析所制備的UCP粒子 當溫度從200 ℃開始逐漸升高時，前體開始發生高溫裂解反應，從細小的晶體逐漸團聚成較大的晶體團簇，在特定溫度（360 ℃），這些小的晶體簇不斷生長、熟化，最終成為規則的納米粒子，見圖1。

圖1 在TOPO溶劑相360 ℃下的納米晶體TEM圖

2.2 熒光光譜儀測定所制備粒子的發光光譜 Er3+摻雜的UCP發光納米晶體，Er3+在不同摻雜濃度下可以發射綠光和紅光2種光譜。分別通過綠色和紅色濾光片捕獲相應光譜，激發通道上的發光均勻通透、強度較高；通過其光譜測定Er3+粒子摻雜的UCP晶體最大發射波長在550 nm左右，紅光發射區域在660 nm左右。在激活粒子摻雜濃度為2%，綠色發射占主要位置；當增大激活離子摻雜比例時，紅光發射所占的比例也相應提高，見圖2。

圖2 Er3+摻雜的UCP晶體（NaYF4:Yb3+，Er3+）光譜圖（白底）和激光激發圖（黑底）

2.3 UCP納米探針對荷瘤動物模型的成像 CCD器件對處于近紅外區的光線依然敏感，利用普通CCD器件拍攝了荷瘤動物的熒光圖像，CCD未進行光譜過濾下的實驗動物和CCD未進行光譜過濾下的腫瘤，見圖3A。CCD前進行光譜過濾下的實驗動物和CCD前進行光譜過濾下的腫瘤，見圖3B。

圖3 上轉換活體實驗動物和腫瘤CCD成像圖

2.4 利用Maestro系統的光譜分析技術對上轉換活體動物的光譜分析 自然光下裸鼠的形態，注射上轉換納米粒子后分別掃描650～660 nm和540～550 nm所顯示的腫瘤熒光圖，見圖4。利用光譜分析系統分離540～550 nm激發區域的熒光光譜，非腫瘤所在區域為紅色激發光，腫瘤所在區域為綠色激發光，540～550 nm光譜峰值為上轉換熒光發光區域，并進行熒光強度測量，取得光子信號計數平均值（average counts signal，acs），根據2種測量信號強度與相應區域作圖比較，見圖5。利用光譜分析系統分離650～660 nm激發區域的熒光光譜，腫瘤所在區域為紅色激發光，非腫瘤所在區域為黃色激發光，650～660 nm光譜峰值為上轉換熒光發光區域，并進行熒光強度測量，取得光子信號計數acs值，根據2種測量信號強度與相應區域作圖比較，見圖6。左后肢部位650～660 nm上轉換發光熒光與自然光疊加后的圖像，用Maestro系統將兩者轉換為強度模式下熒光的強度分布情況，見圖7。右后肢部位540～550 nm上轉換發光熒光與自然光疊加后的圖像，用Maestro系統將兩者轉換為強度模式下熒光的強度分布情況，見圖8。650～660 nm和540～550 nm上轉換發光熒光與自然光疊加后的圖像，用Maestro系統將3者轉換為強度模式下熒光的強度分布情況，見圖9。

圖4 荷瘤動物在自然光及不同波長下的熒光圖

圖5 活體實驗動物腫瘤區域在540～550 nm波長激發光下光譜特征及強度

3 討論

上尿路上皮腫瘤的常規診斷手術目前有CT尿路成像（computed tomography urography，CTU）、輸尿管鏡檢查、尿細胞學檢查等。CTU對于5～10 mm的病灶具有超過95%的敏感性和特異性，但在疾病發生的早期，即鏡下血尿階段的早期上尿路上皮癌的敏感性低下。輸尿管鏡檢查尤其是纖維軟輸尿管鏡可以觀察上尿路的大體形態并可以到達腎盂，可以評估腫瘤的形態，獲取病理活檢標本，但屬于有創操作，且依賴于手術醫師的技術熟練性和腫瘤的大小能否被肉眼可見。尿細胞學檢查陽性對于診斷上尿路上皮癌有很強的提示作用，但尿細胞學陰性并不能排除惡性腫瘤。因此，發展新的診斷手段成為提高上尿路上皮癌治療效果的前提條件。

圖6 活體實驗動物腫瘤區域在650～660 nm波長激發光下光譜特征及強度

圖7 活體實驗動物腫瘤區域在650～660 nm上轉換熒光與自然光疊加圖及其強度分布示意圖

圖8 活體實驗動物腫瘤區域在540～550 nm上轉換熒光與自然光疊加圖及其強度分布示意圖

圖9 活體實驗動物腫瘤區域在650～660 nm和540～550 nm上轉換熒光與自然光疊加圖及其強度分布示意圖

光動力診斷（photodynamic therapy，PDT）因為生物安全性好，且不影響化療和放療，成為近幾年研究的熱點[7]。目前，常見的光敏劑有5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、金絲桃素類化合物、酞菁類化合物。5-ALA在泌尿系統首先被用于早期膀胱癌及轉移癌的診斷，但5-ALA的熒光顯示不但可在膀胱移行細胞癌上，而且增生的膀胱黏膜、鱗狀上皮化生、炎癥或肉芽組織也可出現陽性[8]，且生物利用率低，不利于臨床大規模的推廣[9]。金絲桃素在診斷膀胱癌有較好的特異性和靈敏性[10]，然而，金絲桃素純凈物價格昂貴，并且目前缺乏合適的溶劑保證其在溶液內的溶解度和穩定性。

在光學成像領域中新興的近紅外熒光（nearinfrared fluorescence，NIRF）成像已逐漸受到研究人員的重視[11]。NIRF成像技術能夠通過不同的方式降低背景以提高分辨率，但背景自發熒光依然存在。上轉換發光是一種在紅外光激發下發出可見光的發光現象，研究發現[12]，基于UCP的分子影像探針具有成像的高靈敏度、產生熒光的高度穩定性及生物組織不產生破壞效應，因此非常適用于NIRF成像，此外，UCP納米粒子還是一種非常合適的光敏劑輸送載體，它可以連接特異腫瘤靶向分子，在目標腫瘤部位結合富集。CHATTERJEE等[13]首次報道將聚乙烯亞胺包裹的NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子用于腫瘤細胞和小動物正常組織顯像，結果表明該納米粒子生物相容性好，對骨髓干細胞不產生毒性，腫瘤細胞成像背景自發熒光極低；與量子點比較，UCP納米顆粒能穿透更深的組織發出熒光。本研究以NaYF4為基質材料，摻雜20% Yb3+為敏化離子，摻雜2% Er3+作為激活離子。其中敏化離子的作用是吸收激發光能量，并將其轉移給激活離子，作為激活離子的這些稀土元素具有豐富的能級，在激發光下產生較強的發射光譜。對于上轉換發光成像，由于其原理在于近紅外光源激發，但對于CCD器件，其對處于近紅外區的光線仍然敏感，因此普通的CCD成像對于發射光譜的影響主要在于所照射部位的近紅外反射光，這種反射光在CCD上成像呈現粉白色，見圖3A。通常的錯誤認識是認為激發光源不純，出現了其他發射波長的光譜，因而影響了CCD的成像，但我們可通過在CCD前進行光譜過濾，去除激發光干擾，見圖3B。

先前的光學成像的靶點大多聚焦在特異性的腫瘤細胞上，將特異性的生物探針與納米粒子耦合，然后輸入動物體內，通過被動吸收和主動吸收途徑與腫瘤細胞靶向結合成像。遺憾的是，這種模式在診斷早期上尿路上皮癌上有著巨大的局限性，可能與腫瘤缺乏足夠的特異性分子標記以及分子探針與納米粒子耦合后，改變了探針的生物活性等因素有關。研究發現：腫瘤細胞與鄰近宿主各成分之間相互作用后可形成腫瘤-宿主界面微環境[14]，腫瘤細胞的生長速度快，組織代謝活性高，從而導致微環境低氧和酸性增高[15]。腫瘤的微環境選擇誘導能在惡性環境下生存的腫瘤細胞，并促使其繼續惡變，尤其是酸性微環境與腫瘤的發生、增殖、轉移都有著密切關系。“生物納米針筒”技術[16]合成了一種能靶向聚集在酸性組織，并能夠嵌入到細胞膜內pHLIP的小片段蛋白質，應用近紅外熒光染料Cy5.5 與pHLIP結合構建靶向探針，對鼠乳腺癌模型進行近紅外熒光成像。結果表明，pHLIP插入細胞膜不會造成膜損傷，且自身非常穩定，在腫瘤酸性微環境組織中明顯富集。直接插入質膜比其他抗體類靶向探針在腫瘤部位富集程度要高得多，所以彌補了腫瘤缺乏足夠的特異性分子標記的缺點。我們同樣利用了生物針筒技術這個特點，將pHLIP與UCP納米粒子鏈接后，利用上轉換發光檢測結合Maestro光譜分析系統可以清晰地識別富集在表皮不同部位的 UCP納米粒子，并且可以通過分析得到相關部位的光譜及強度等數據。以此作為模型，驗證了上轉換發光的低背景發射以及高的信噪比等特征。發現pHLIP-UCP納米粒子在成像時的背景熒光S/N為107，而熒光區域的S/N為1346，背景熒光幾乎不存下，這說明背景熒光幾乎沒有存在，在注射較強發光的上轉換納米粒子情況下，腫瘤細胞富集的區域可以得到極強的熒光信號。由于沒有背景熒光，所以在近紅外激光激發下幾乎看不到小鼠的形態，見圖7和圖8。將熒光圖片與自然光圖片進行疊加后可清晰地進行熒光定位；而轉換為強度模式下熒光的強度分布情況，顯示探針在腫瘤接種部位較高的富集程度，見圖7和圖9。因此，提示pHLIP-UCP納米探針對于診斷早期上尿路上皮癌具有高敏感性與特異性。

利用上轉換發光不會產生背景熒光的特性，建立上尿路上皮癌上轉換活體動物成像的納米探針，通過研究表明此探針具有極高的信噪比，由于UCP納米粒子發光強度高、不淬滅、組織背景熒光低，因此很適合臨床早期尿路上皮腫瘤的顯像應用。

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（本文編輯：吳彬）

Imagination of novel targeted molecular imaging probes in the early diagnosis of upper urinary tract epi-thelial carcinoma model

LIAO Guodong1, WANG Lijiang2, YU Weiwen1, ZHANG Jianshe3.
1.Department of Urology, Zhejiang Provincial People’s Hospital, Hangzhou, 310014; 2.Zhejiang University California International Nanosystems Institute, Zhejiang University, Hangzhou, 310027; 3.School of Basic Medical Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the characteristic and tumor targeting of up-converting phosphor (UCP) nano-probe in labeling orthotopic transplantation tumor of early upper urinary tract urothelial carcinoma in vivo. Methods: Water soluble UCP was synthesized by high temperature pyrolysis. Then, UCP was link to the pH (low) insertion peptide (pHLIP). Imaging of urothelial tumors in a tumor bearing animal model by pHLIPUCP probe was proceeded using a small animal in vivo multispectral Maestro imaging system (CRI). Results: NaYF4:Yb3+, Er3+upconversion nanocrystals were synthesized with good dispersibility, small particle size and high solution permeability. The upconversion luminescence signal of the UCP nanoprobe had stable luminescence and high sensitivity in the dark environment. Conclusion: The UCP nanoprobe can specifically bound to orthotopic transplanted tumor of upper urinary tract urothelial cancer in vivo, which shows the potential for in vivo imaging of early upper urinary tract epithelial carcinoma.

upper urinary tract epithelial carcinoma; nanoprobe; upconversion imaging; animal model

R604

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.001

2017-01-16

國家自然科學基金青年基金資助項目（30900346）；浙 江省自然科學基金資助項目（Y2101402）；浙江省公益性技術應 用研究計劃項目（2014C33129）。

廖國棟（1977-），男，湖南衡陽人，主治醫師，博士。