隱丹參酮對表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

易 輝，祖瑞鈴，易玉玲，李 燕

(成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 611137)

隱丹參酮對表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

易 輝，祖瑞鈴，易玉玲，李 燕

(成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 611137)

目的探索隱丹參酮對表皮葡萄球菌(SE)生物膜不同成熟階段的抑制效果。方法體外構建SE生物膜模型，確定其黏附、聚集、成熟階段時間點；通過半定量黏附實驗、XTT法和掃描電鏡檢測不同濃度隱丹參酮作用下SE不同成熟階段中生物膜基質量、膜內菌代謝活性和微觀形態結構的變化。結果SE生物膜黏附、聚集和成熟時間點分別為6、24、48 h；對于黏附階段生物膜，128 μg/mL和32 μg/mL的隱丹參酮均能明顯減少其生物膜基質量和殺滅膜內菌，差異有統計學意義(P<0.05)，且隱丹參酮抑制作用128 μg/mL優于32 μg/mL，差異有統計學意義(P<0.05)，同時均能破壞其微觀形態結構；對于聚集與成熟階段生物膜，僅128 μg/mL的隱丹參酮能明顯減少其生物膜基質量和殺滅膜內菌，差異有統計學意義(P<0.05)，同時能破壞其微觀形態結構，而32 μg/mL的隱丹參酮則無明顯抑制效果(P>0.05)。結論隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段均具有一定抑制效果，且存在一定的劑量效應。

表皮葡萄球菌； 生物膜； 隱丹參酮

[Chin J Infect Control，2017，16(9)：798-803]

近年，高分子材料制成的醫療植入物的廣泛應用，如導管、人工心瓣膜、人工關節等，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)所致感染日趨嚴重，已位于醫院感染病原體的第四位。研究[1]表明，細菌黏附于醫療植入物表面形成生物膜是該菌致病、難以治愈、容易復發的主要原因。目前，臨床多采用大劑量的抗菌藥物治療此類感染，造成該菌耐藥性加劇，相對而言，中藥不易造成細菌耐藥，在新藥研發中具有一定的優勢。丹參作為川產道地藥材，臨床常用功效為祛瘀止痛、活血通經、清心除煩，其有效成分分為脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸兩大類，其中丹參酮類化合物(即總丹參酮)還具有抗菌、抗炎作用，但研究和臨床應用較少。已有研究[2]發現，丹參根甲醇提取物對SE、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等浮游菌表現出較強的抑菌活性，且價格低廉，具有進一步開發應用潛力。目前，國內外尚未見丹參酮抑制細菌生物膜形成的相關報道，本課題組的前期研究中，通過測定總丹參酮及其主要單體成分丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ對SE的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小生物膜抑菌濃度(minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC)，發現隱丹參酮為丹參酮類化合物中對SE抑菌活性最強的單體成分，故本研究選用隱丹參酮作為靶藥，以萬古霉素為陽性對照藥物，觀察不同濃度藥物作用下SE生物膜形成過程不同階段基質量、膜內菌代謝活性和微觀形態結構的變化，探索不同濃度隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 表皮葡萄球菌1457(生物膜陽性株)和表皮葡萄球菌ATCC 12228(生物膜陰性株)，均由復旦大學瞿滌教授惠贈；臨床菌株：本實驗室從成都地區兩所醫院收集、鑒定、保存的5株臨床生物膜陽性菌株[3-4]。

1.1.2 主要試劑與儀器 包括隱丹參酮對照品(成都普菲德生物公司)、萬古霉素標準品(中國食品藥品檢定研究院)、XTT試劑(南京凱基生物科技公司)、無菌96孔板和6孔板(美國Costar公司)、酶標儀(Nanodrop 2000)、掃描電鏡(日立 1000B)。

1.2 方法

1.2.1 SE黏附、聚集、成熟階段生物膜的建立 參照文獻[5-6]方法略做改動：SE接種至TSB培養基37℃過夜培養，調節菌液濃度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中，分別于37℃ 0、3、6、12、24、36、48、72、96 h結束培養，無菌PBS漂洗3次；2.5%戊二醛固定30 min，棄去孔內液體；0.1%結晶紫染液染色5～15 min，自來水沖洗未黏附染料，室溫晾干；加入95%乙醇微振蕩，酶標儀檢測A570值，繪制生物膜基質生長曲線。

1.2.2 藥物處理 SE接種至TSB中37℃過夜培養，調節菌液濃度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中37℃培養，分別于1.2.1確立的時間點結束培養，無菌PBS漂洗3次，200 μL/孔加入以下實驗分組(見表1)的藥液，37 ℃培養24 h。

表1生物膜形成階段和實驗分組情況

Table1Biofilm formation periods and experimental groups

生物膜形成階段及實驗分組干預藥物 藥物終濃度(μg/mL)6h(黏附) A1不加藥對照0 A2萬古霉素32 A3高濃度隱丹參酮128 A4低濃度隱丹參酮3224h(聚集) B1不加藥對照0 B2萬古霉素32 B3高濃度隱丹參酮128 B4低濃度隱丹參酮3248h(成熟) C1不加藥對照0 C2萬古霉素32 C3高濃度隱丹參酮128 C4低濃度隱丹參酮32

1.2.3 半定量黏附實驗檢測SE生物膜基質的變化 參照文獻[7]方法略做改動：按照1.2.2中方法處理后，無菌PBS漂洗3次，戊二醛固定30 min，結晶紫染液染色5～15 min，自來水沖洗，室溫晾干，加入95%乙醇微振蕩，檢測A570值。

1.2.4 XTT法檢測SE生物膜內細菌代謝活性變化 參照文獻[8-9]方法略做改動：按照1.2.2中方法處理后，無菌PBS漂洗3次，加入 100 μL MH培養基和50 μL XTT工作液，37℃避光培養1～4 h，酶標儀檢測A450值。

1.2.5 掃描電鏡觀察SE生物膜微觀形態變化 按文獻[10]方法略做改動：調節SE菌液濃度至1×106CFU/ mL，3 mL/孔加入到無菌6孔板中，每孔加入一片無菌玻片，分別于37℃ 6、24、48 h結束培養，取出玻片用無菌PBS漂洗3次，然后放入新的無菌6孔板中，3 mL/孔加入表1中實驗分組的藥液，37℃培養24 h，取出玻片用無菌PBS漂洗3次，戊二醛4℃固定2 h，無菌PBS漂洗，依次用濃度為30%、50%、70%、70%、80%、90%、100%的乙醇，4℃梯度脫水10 min，叔丁醇置換及真空干燥后噴金進行掃描電鏡觀察拍照(10 000×，10 μm視野)。

2 結果

2.1 SE生物膜生長曲線及黏附、聚集和成熟時間點確立 SE生物膜生長有3個增長期，分別是0～12 h、12～36 h和36～72 h，其中0～12 h增長最快，對應生物膜黏附期，此時浮游SE正不斷黏附到聚丙乙烯微孔板上；12～36 h增長第二快，對應生物膜聚集期，此時已經黏附于聚丙乙烯微孔板上的SE相互聚集并合成分泌大量胞外基質逐漸形成微菌落，同時生物膜也逐漸走向成熟；36～72 h生物膜基質量增長緩慢，對應生物膜成熟期，此時主要是已形成的微菌落之間相互融合生長，發育成具有蘑菇狀結構的成熟生物膜。因此，本實驗分別選擇各階段中間時間點6、24、48 h作為SE生物膜的黏附、聚集和成熟點進行藥物干預。見圖1。表皮葡萄球菌 ATCC 12228為生物膜形成陰性株，不能在聚丙乙烯微孔板上形成生物膜，故其黏附于微孔板上的細菌量基本保持不變。

圖1 SE生物膜生長曲線

2.2 藥物作用下SE生物膜基質的變化 SE不同階段生物膜基質量的變化見圖2。

圖2SE生物膜基質量的變化

Figure2Change in quantity ofS.epidermidisbiofilm matrix

黏附階段：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組、128 μg/mL隱丹參酮組和32 μg/mL隱丹參酮組生物膜基質量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但128 μg/mL和32 μg/mL隱丹參酮組的抑制作用均不及32 μg/mL萬古霉素組，差異有統計學意義(P<0.05)；32 μg/mL隱丹參酮組又不及128 μg/mL隱丹參酮組，差異有統計學意義(P<0.05)。

聚集階段：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組和128 μg/mL隱丹參酮組生物膜基質量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而32 μg/mL隱丹參酮組則無降低。

成熟階段：與不加藥對照組相比，僅128 μg/mL隱丹參酮組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，32 μg/mL萬古霉素組和32 μg/mL隱丹參酮組的降低無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 藥物作用下SE生物膜內細菌代謝活性變化 SE不同階段生物膜膜內菌代謝活性變化見圖3。黏附和聚集階段呈現結果一致：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組、128 μg/mL隱丹參酮組和32 μg/mL隱丹參酮組生物膜膜內菌代謝活性均明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；但 128 μg/mL和32 μg/mL隱丹參酮組的抑制作用均不及32 μg/mL萬古霉素組，差異有統計學意義(P<0.05)；32 μg/mL隱丹參酮組又不及128 μg/mL隱丹參酮組，差異有統計學意義(P<0.05)。成熟階段：與不加藥對照組相比，僅32 μg/mL萬古霉素組和128 μg/mL隱丹參酮組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而32 μg/mL隱丹參酮組則無明顯降低。

圖3SE生物膜內細菌代謝活性變化

Figure3Change in metabolism ofS.epidermidisinside biofilm

2.4 藥物作用下SE生物膜微觀形態變化 掃描電鏡下SE不同階段生物膜微觀形態見圖4。黏附階段：不加藥對照組生物膜形態結構完整，而萬古霉素組、高濃度和低濃度隱丹參酮組生物膜結構均被破壞瓦解。聚集和成熟階段：呈現相似的抑制效果，不加藥對照組生物膜結構復雜完整，膜內細菌形態正常，SE分泌了大量胞外基質將細菌包裹于生物膜之中，而低濃度隱丹參酮組生物膜結構無明顯變化，萬古霉素組和高濃度隱丹參酮組生物膜結構雖然存在，但是膜結構遠遠不如不加藥對照組完整緊密，且膜厚度明顯減低，膜內細胞可見變形、皺縮、或死亡。

注：A1、B1、C1分別為黏附、聚集、成熟階段不加藥對照組；A2、B2、C2分別為黏附、聚集、成熟階段32 μg/mL萬古霉素作用組；A3、B3、C3分別為黏附、聚集、成熟階段128 μg/mL隱丹參酮作用組；A4、B4、C4分別為黏附、聚集、成熟階段32 μg/mL隱丹參酮作用組

圖4掃描電鏡下SE生物膜微觀形態(10 000×，10 μm)

Figure4Change in microstructure ofS.epidermidisbiofilm observed by SEM(10 000×，10 μm)

3 討論

一直以來，中藥在控制細菌感染及多重耐藥性方面具有獨特的優勢，已成為繼抗生素之后又一抗感染藥物研究的重點。近年來，國內外學者研究發現中藥或中藥活性成分在抑制細菌生物膜方面顯現了一定的優勢，Zeng等[11]發現穿心蓮內酯能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜胞外基質的形成，并與多種抗菌藥物聯用表現出協同抗菌效果；Pammi等[12]發現，金合歡醇能夠抑制SE生物膜形成，并與利福平和萬古霉素顯現出協同抗菌作用。丹參作為常用的天然藥物，臨床主要用于治療心腦血管疾病，對其活血化淤、清心除煩的藥理藥效研究較多，而對丹參的抗炎、抗菌作用研究和臨床應用較少。丹參的脂溶性提取物(丹參酮類化合物)作為丹參發揮抗菌作用的最主要物質基礎，對大多數細菌表現出抑制作用，特別是對葡萄球菌屬細菌等革蘭陽性菌[13-14]。Lee等[13]測定了隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ對多種革蘭陽性菌和陰性菌的MIC值，發現二者對SE抑菌效果好，MIC分別為6.3 μg/mL和3.1 μg/mL；Feng等[15]采用隱丹參酮對臨床21株金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，得到隱丹參酮對21株菌的MIC為4～64 μg/mL，具有較好的抑菌效果。盡管已有隱丹參酮抑制細菌浮游菌生長的相關報道，但目前尚未見其抑制細菌生物膜形成的報道。故本研究選擇隱丹參酮為靶藥，觀察隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段的抑制效果，為丹參酮用于預防和治療生物膜耐藥SE感染的可能性提供實驗依據。

生物膜是依附于某載體表面的，由胞外多聚物和基質包被的高度組織化、系統化的微生物膜性聚合物，其臨床意義為不斷釋放膜內細菌造成感染遷延不愈。對于生物膜狀態的致病菌，根據臨床傳統的抗菌藥物敏感性試驗所得到的抗菌藥物治療濃度已經完全不能控制此類感染。已有大量證據表明，殺死生物膜內細菌所用的抗生素濃度是殺死浮游菌所用抗生素濃度的10～1 000倍，因此，目前美國傳染病協會提出了抗生素鎖定技術(antibiotic lock technique，ALT)用于治療生物膜引起的醫療植入物相關感染[16]。基于ALT的提出，目前許多研究者通過在體外建立生物膜模型，然后使用10～1 000倍MIC的抗菌藥物作用于生物膜，觀察藥物清除生物膜所需的濃度及時間，以便更加準確地為臨床指導用藥。如Lee等[17]依據ALT，發現5 mg/mL的萬古霉素、5 mg/mL的環丙沙星和5 mg/mL的利福平能夠在5 d內清除SE生物膜。根據本課題組前期實驗中用二倍稀釋法測得隱丹參酮對SE的MIC為2 μg/mL，MBIC為32 μg/mL，故本研究選擇的低濃度隱丹參酮作用濃度為32 μg/mL(16倍MIC)，高濃度隱丹參酮為128 μg/mL(64倍MIC)，觀察藥物作用生物膜的劑量效應。同時，通過建立SE生物膜生長曲線，以確定細菌黏附、聚集和成熟各個階段時間點，在不同時間點給予藥物干預，從而更加全面、深入地探討藥物對其抑制效果。由于萬古霉素是臨床治療葡萄球菌感染的最后一道防線，故本研究選擇其為陽性對照藥物。

本研究首次證明了隱丹參酮一定程度上能夠抑制SE生物膜各個階段基質形成、膜內菌代謝活性、破壞生物膜整體微觀形態，且此抑制作用存在一定的劑量效應。隨著生物膜成熟度的增高，高濃度的隱丹參酮抑制作用強于低濃度的隱丹參酮，甚至對于成熟生物膜結構，低濃度的隱丹參酮并不能發揮抑制作用，證實了細菌形成生物膜后耐藥性會明顯增強，臨床必須使用高劑量的藥物濃度才能達到控制生物膜感染的目的，也說明應進一步設置藥物作用的濃度梯度，尋找抑制生物膜形成的藥物濃度拐點，才能真正為隱丹參酮防治生物膜耐藥的SE感染提供科學的、有價值的實驗依據。

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(本文編輯：左雙燕)

InhibitoryeffectofcryptotanshinoneonbiofilmofStaphylococcusepidermidis

YIHui,ZURui-ling,YIYu-ling,LIYan

(CollegeofMedicalTechnology,ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of cryptotanshinone on different maturation stages ofStaphylococcusepidermidis(S.epidermidis) biofilm.MethodsThe biofilm model ofS.epidermidiswas constructed in vitro, the timing of adhesion, accumulating, and maturation was determined; matrix quantity, bacterial metabolism, microstructure of biofilm were detected with semi-quantitative adhesion test, XTT assay, and scanning electron microscope(SEM) respectively.ResultsThe timing of adhesion, accumulating, and maturation ofS.epidermidisbiofilm were 6h, 24h,and 48h respectively; in adhesion period, cryptotanshinone at the concentration of 128μg/mL and 32μg/mL could both obviously reduce the matrix and kill bacteria inside biofilm, difference was statistically significant(P<0.05)，inhibitory effect of 128μg/mL cryptotanshinone was better than 32μg/mL (P<0.05), the microstructure was destroyed by both concentrations. During accumulating and mature period, only cryptotanshinone at 128μg/mL could reduce the matrix of biofilm and kill bacteria inside biofilm (P<0.05), the microstructure was damaged by cryptotanshinone at concentration of 128μg/mL, while 32g/mL of cryptotanshinone had no obvious inhibitory effect(P>0.05).ConclusionCryptotanshinone has a certain inhibitory effect on different stages ofS.epidermidisbiofilm, and there is a certain dose effect.

Staphylococcusepidermidis; biofilm; cryptotanshinone

2016-11-24

四川省科技廳應用基礎項目(2015JY0159)

易輝(1991-)，女(漢族)，四川省成都市人，碩士研究生，主要從事感染微生物的實驗診斷及耐藥性研究。

李燕 E-mail：1067267085@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.09.002

R378.1+1

A

1671-9638(2017)09-0798-06