克羅恩病患兒血清細胞因子水平的研究

盧華君，趙忠艷，林小春，方玲娟，閆秀梅，黃開宇

(溫州醫科大學附屬第二醫院 育英兒童醫院兒童消化科，浙江 溫州 325027)

克羅恩病患兒血清細胞因子水平的研究

盧華君，趙忠艷，林小春，方玲娟，閆秀梅，黃開宇

(溫州醫科大學附屬第二醫院 育英兒童醫院兒童消化科，浙江 溫州 325027)

目的 通過研究克羅恩病(CD)患兒血清細胞因子水平，探討其在兒童CD發病與發展中的作用。方法 采用流式微球分析技術，檢測2013年1月至2015年12月在溫州醫科大學附屬第二醫院住院的32例CD患兒和30名正常對照兒童的血清白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、IL-17A水平，并進行統計分析。結果 CD患兒血清中的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17A水平均顯著高于正常對照組(t值分別為2.822、2.643、5.713、2.962、3.183，均P<0.05)；而血清中的IL-10、IFN-γ水平則顯著低于正常對照組(t值分別為2.554、2.634，均P<0.05)。此外，兒童CD活動指數(PCDAI)評分為中重度的患兒血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平顯著高于評分為輕度的患兒(t值分別為2.233、2.332、2.531，均P<0.05)；而血清IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平的PCDAI評分則中重度活動與輕度活動CD患兒差異均無統計學意義(均P>0.05)。結論 與正常兒童相比，CD患兒存在明顯細胞因子水平變化，而且疾病活動度不同其細胞因子水平亦有差異，提示細胞因子水平紊亂在兒童CD發病及病情的發展中有重要作用。

克羅恩病；細胞因子；流式細胞術；兒童

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)是一種非特異性的消化道炎癥性疾病，病變可累及消化道的各個部位，特別是末段回腸和結腸，也可累及全身各個系統。該病臨床表現復雜，發病機制也不完全清楚。既往研究支持CD是一種腸道免疫平衡失調的表現，涉及多種炎癥細胞與炎癥介質的作用。兒童CD為早期發病亞型，與成人CD相比，對兒童CD研究相對滯后。因此，研究CD患兒的免疫應答變化有助于闡明兒童CD的致病機理，對于指導對CD患兒的治療有重要意義。本研究擬通過檢測CD患兒血清中白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等細胞因子水平，分析其與兒童CD的關系，探討兒童CD的發病機制及個體的免疫應答情況。

1對象和方法

1.1研究對象及分組

病例組為2013年1月至2015年12月在溫州醫科大學附屬第二醫院兒童內科住院的CD患兒32例，其中男18例，女14例，年齡7～15(8.5±4.3)歲。所有病例經過胃腸鏡、影像學和組織病理學檢查，結合臨床表現確診，診斷標準參考有關文獻[1]。病例采用兒童CD活動指數(PCDAI)對患兒疾病活動度進行評分，0～10分為不活動，11～30分為輕度活動，≥31分為中/重度活動。32例CD患兒包括輕度活動12例，中重度活動20例，無不活動患兒。正常對照組為30名同期在本院門診體檢的健康兒童，其中男18例，女12例，年齡6～13(10±3.5)歲。兩組年齡、性別比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。病例組和對照組所有兒童均晨起空腹用干燥試管采集靜脈血2mL用于細胞因子水平檢測。

1.2細胞因子的檢測

干燥試管采集的靜脈血靜置后離心取得血清，用EP管分裝，置-80℃冰箱保存備用。采用流式微球分析(cytometric bead assay，CBA)技術檢測血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A這7種細胞因子水平。細胞因子檢測試劑盒由BD公司提供。檢測方法參考有關文獻[2]。

1.3統計學方法

2結果

2.1兩組兒童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的檢測結果

病例組患兒血清IL-2、IL-4和IL-6水平明顯高于對照組，而血清IL-10水平則明顯低于對照組，兩組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組兒童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平的比較結果

2.2兩組兒童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A的檢測結果

病例組患兒血清中TNF-α、IL-17A水平明顯高于對照組，而IFN-γ水平則明顯低于對照組，兩組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

2.3中重度活動與輕度活動克羅恩病患兒血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比較

血清IL-2水平在中重度活動組顯著高于輕度活動組(P<0.05)，而兩組患兒血清中IL-4、IL-6和IL-10水平差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

表2 兩組兒童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平的比較結果

表3 不同活動度CD患兒血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比較結果

2.4中重度活動與輕度活動克羅恩病患兒血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比較

中重度活動患兒血清TNF-α和IL-17A水平均顯著高于輕度活動患兒(均P<0.05)，而兩組患兒血清IFN-γ水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同活動度CD患兒血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比較結果

3討論

3.1兒童克羅恩病的臨床特征

兒童CD是一種發生于兒童時期的非特異性的消化道慢性炎癥性疾病。目前國內兒童CD發病率尚無確切報道，國外資料顯示兒童CD的發病率為5/10萬～6.6/10萬，且呈逐漸上升趨勢[3-4]。由于兒童CD臨床表現不典型且缺乏特異性實驗室檢查，診斷比較困難。兒童CD的診斷需要根據臨床表現并結合輔助檢查綜合判斷。兒童CD臨床主要表現為腹痛、腹瀉、血便，其中腹痛最常見[5]。部分病例可表現為腸套疊、腸梗阻；部分患兒在病程中可出現發熱。此外，兒童CD往往存在消瘦、貧血、低蛋白血癥等營養不良表現。針對兒童CD的主要輔助檢查手段包括影像學檢查、消化內鏡檢查、組織病理學檢查等。腹部B超能監測腸壁的血供及動力狀態，發現腸壁的不均勻性、階段性增厚情況，可作為兒童CD診斷時的有效線索。消化內鏡檢查是診斷兒童CD的必要手段，內鏡下兒童CD病變主要表現為黏膜破壞和慢性增生同時存在，典型病例能見到縱行裂隙狀潰瘍及鋪路石樣改變，但在早期病變不典型的情況下，易與腸結核、潰瘍性結腸炎、腸道腫瘤等疾病相混淆。兒童CD的組織病理學改變無特異性，以黏膜的慢性非特異性炎癥改變為主，有時可見干酪性肉芽腫。因此病理學表現在疾病診斷早期僅能作為參考條件。血常規、血沉及C-反應蛋白、血漿白蛋白在疾病活動期均有不同程度的改變，可作為監測疾病活動情況的有效指標[6]。

3.2兒童克羅恩病的發病機制

兒童CD的發病機制目前不清楚，其病因學一直是研究的熱點。目前認為CD的發病與遺傳、環境、感染和免疫等多種因素相互作用有關，屬于自身免疫性疾病的一種，免疫調節紊亂是其發病的關鍵因素。腸道的免疫平衡是由調節性T細胞和免疫性T細胞調控，免疫性T細胞可以分為輔助性T細胞(Th)以及細胞毒性T細胞。如果免疫性T細胞過度增生、免疫原性增強，或調節性T細胞數量減少、功能異常，均可打破兩者平衡，從而誘發CD，導致腸黏膜損傷。在CD的免疫應答中，Th是主要的參與者。Th在不同細胞因子的刺激下，可以分為Th1、Th2。Th1型細胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等；Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等。目前認為CD的發病是以Th1介導為主，其中TNF-α已引起廣泛注意。有研究表明，TNF-α是CD發病中一個重要的促炎因子[7]。動物實驗研究發現，去除小鼠T細胞TNF-α基因的3'非翻譯區會導致TNF-α水平升高并產生CD樣的表型，形成節段性累及腸壁全層的肉芽腫性腸炎[7]。本研究中CD患兒血清IFN-γ和IL-10明顯低于正常對照組，而IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平則明顯高于對照組。IFN-γ是最典型的Th1型細胞因子，具有抗炎癥活性，其降低可能導致機體抵抗炎癥反應的能力降低。與正常對照組兒童相比，CD患兒血清IL-10濃度降低，提示可能由于存在某種因素抑制了IL-10的產生，導致不能削弱機體的細胞免疫反應，細胞因子網絡失衡。由于IL-4的異常升高可刺激B細胞分泌IgE，而IFN-γ是一個IgE合成的潛在抑制物，那么IL-4與IFN-γ的失衡就可能使患兒IgE水平增高，從而引起了一系列腸黏膜炎癥改變。CD患兒血清IL-2水平的升高，可能與多種細胞因子水平的變化并相互誘生有關。CD患兒巨噬細胞合成并分泌大量TNF-α，直接損傷血管內皮細胞，加重了消化道組織的損傷。而消化道組織的損傷又促使TNF-α因子的釋放，形成惡性循環，造成消化道炎癥反應的反復發生和遷延不愈。Th17細胞是一群新近鑒定的CD4+效應T細胞，該細胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等細胞因子，具有很強的促炎癥作用，其中最主要的是IL-17A，其與Th1、Th2、調節性T細胞一起廣泛參與了機體的免疫防御及免疫調節過程。IL-17可能通過激活細胞因子、趨化因子，增加TNF-α誘導的消化道平滑肌細胞的IL-6表達，從而促進中性粒細胞的成熟和激活。Strober等[8]研究發現，在CD患者腸道炎癥黏膜中，Th1相關的細胞因子(如TNF-α、IFN-γ)和Th17相關細胞因子(如IL-17A)顯著升高，與本研究CD患兒血清細胞因子變化相類似。本研究還發現，中重度活動CD患兒血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平顯著高于輕度活動CD患兒，而IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平則均無顯著性差異，提示TNF-α、IL-2和IL-17A在兒童CD疾病發展及活動中可能起重要作用。

3.3兒童克羅恩病的治療

兒童CD的治療目前尚無統一且絕對有效的方案。除了一般營養治療外，糖皮質激素、5氨基水楊酸(5-ASA)、6-巰基嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、沙利度胺等均可用于兒童CD的治療。有研究者認為，CD患兒在患病早期應用抗TNF-α制劑治療的效果優于一般免疫治療[7]。英夫利西(infliximab，IFX)為抗TNF-α單克隆抗體，可通過與巨噬細胞和T細胞表面表達的TNF-α高親和力結合而拮抗TNF-α的生物活性。通過抗體依賴性細胞毒作用、補體依賴性細胞毒作用及影響細胞的信號轉導途徑，最終加速細胞周期阻滯、凋亡及抑制細胞因子產生[9]。

本研究結果提示，與健康兒童相比，CD患兒存在血清細胞因子水平的紊亂，而且疾病活動度不同其細胞因子水平亦有差異，提示細胞因子水平紊亂在兒童CD發病及病情的發展中有重要作用。如果能深入探討CD患兒的免疫應答變化，將有助于闡明兒童CD的發病機制及進行個體化免疫干預治療。

[1]中華醫學會兒科學會消化學組兒童炎癥性腸病協作組.兒童炎癥性腸病診斷規范共識意見[J].中國實用兒科雜志,2010,25(4):263-265.

[2]盧華君,趙忠艷,李云芳,等.呼吸道腺病毒感染患兒細胞因子及淋巴細胞亞群的研究[J].中國人獸共患病學報,2013,29(8):808-811,816.

[3]Adamiak T, Walkiewicz-Jedrzejczak D, Fish D,etal.Incidence,clinical characteristics, and natural history of pediatric IBD in Wisconsin:a population-based epidemiological study[J].Inflamm Bowel Dis,2013,19(6):1218-1223.

[4]Urlep D, Trop T K, Blagus R,etal.Incidence and phenotypic characteristics of pediatric IBD in northeastern Slovenia, 2002—2010[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2014,58(3):325-332.

[5]唐碩,吳小平,游潔玉.兒童克羅恩病10例臨床分析[J].中國當代兒科雜志,2014,16(8):824-828.

[6]De Greef E, Mahachie John J M, Hoffman I,etal.Profile of pediatric Crohn's disease in Belgium[J].J Crohns Colitis,2013,7(11):e588-e598.

[7]Walters T D, Kim M O, Denson L A.Increased effectiveness of early therapy with anti-tumor necrosis factor-α vs an immunomodulator in children with Crohn’s disease[J].Gastroenterology,2014,146(2):383-391.

[8]Strober W, Fuss I J.Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J].Gastroenterology,2011,140(6):1756-1767.

[9]吳芳,占強.英夫利西單抗治療克羅恩病中免疫平衡及細胞因子的變化和意義[J].醫學綜述,2012,18(23):3947-3949.

[專業責任編輯：肖延風]

Serum cytokine level in children with Crohn’s disease

LU Hua-jun, ZHAO Zhong-yan, LIN Xiao-chun, FANG Ling-juan, YAN Xiu-mei, HUANG Kai-yu

(DepartmentofPediatricGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,ZhejiangWenzhou325027,China)

Objective To explore the serum cytokine level in children with Crohn’s disease (CD) and to investigate its relationship with incidence and development of CD in children. Methods Serum interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ and IL-17A levels in 32 children with CD hospitalized in Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University from January 2013 to December 2015 and in 30 healthy children were detected using flow cytometry and test results were analyzed statistically. Results Serum levels of IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α and IL-17A in children with CD were significantly higher than those in healthy controls (tvalue was 2.822, 2.643, 5.713, 2.962 and 3.183, respectively, allP<0.05), while serum levels of IL-10 and IFN-γ in CD children were much lower than those in healthy controls (tvalue was 2.554 and 2.634, respectively, bothP<0.05). In addition, serum levels of TNF-α, IL-2 and IL-17A in moderate and severe cases identified by pediatric Crohn’s disease activity index (PCDAI) were significantly higher than in mild cases (tvalue was 2.233, 2.332 and 2.531, respectively, allP<0.05). But serum levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10 in moderate and severe cases identified by PCDAI had no significant difference compared to those in mild cases (allP>0.05). Conclusion Compared to healthy children, serum cytokine levels in children with CD change significantly, and cytokine levels are different in cases at different degree of disease activity, indicating that cytokine level disorder may play an important role in incidence and development of pediatric CD.

Crohn’s disease(CD); cytokine; flow cytometry ; children

2016-11-10

溫州市科技局資助項目(Y20120085)

盧華君(1977—)，男，主治醫師，碩士，主要從事兒童消化道疾病的研究。

黃開宇，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.007

R725.7

A

1673-5293(2017)08-0913-03