膝眼穴針灸對大鼠膝關節軟骨細胞表型以及PGC-1α信號通路的影響

苗巖松,徐卿榮,李 鶴,姚菊芳,董宇啟

·實驗與臨床·

膝眼穴針灸對大鼠膝關節軟骨細胞表型以及PGC-1α信號通路的影響

苗巖松,徐卿榮,李 鶴,姚菊芳,董宇啟

目的 研究膝眼穴針灸療法對膝關節軟骨細胞表型改變及其參與線粒體生成氧自由基(ROS)的過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子1α(PGC-1α)信號通路變化的影響。方法 通過免疫組化技術檢測膝眼穴針灸后大鼠膝關節軟骨細胞表型的主要特征分子指標 (col 1、col 2、aggrecan)以及 PGC-1α、線粒體轉錄因子A(TFAM)、解耦聯蛋白2(UCP 2)和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)因子的表達變化。進一步檢測向大鼠膝關節腔內注射ZN005L(PGC-1α激活劑)激活PGC-1α表達后大鼠軟骨細胞表型特征分子指標的表達變化，以及軟骨細胞內ROS生成量的改變。結果 對大鼠進行膝眼穴針灸后，PGC-1α表達增加；UCP 2以及軟骨細胞表型主要指標aggrecan表達下降。激活PGC-1α表達后，軟骨細胞內ROS的生成量降低，并且軟骨細胞表型丟失現象被抑制。結論 膝眼穴針灸療法不能改善大鼠膝關節軟骨細胞的功能，相反會促進軟骨細胞表型特征分子的丟失，并損害軟骨細胞功能。

膝眼穴針灸;軟骨細胞表型;過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子1α；線粒體轉錄因子A；解耦聯蛋白2

隨著人口老齡化的發展，骨關節炎的發病率呈現逐年升高的趨勢[1-2]。而改善軟骨細胞表型維持軟骨的正常功能，對降低骨關節炎的發病率有重要的影響。Col 1與col 2分別為Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原，正常的關節軟骨細胞含有大量col 2及微量col 1，col 2對關節軟骨起到防護支撐的作用。Aggrecan為聚集蛋白聚糖，其主要功能是作為結締組織的纖維成分，與膠原網架結構共同構成一個彈性體，承載壓力，傳導和緩沖應力，起著保護軟骨的作用。軟骨細胞表型的丟失，主要表現為col 2和aggrecan表達下降以及col 1表達升高，并且向纖維細胞形態轉變[3-5]，導致正常關節軟骨功能被破壞。中醫認為通過膝關節相關穴位針刺療法可以使膝關節周圍的肌肉松弛，促進血液循環，進而消除膝關節炎癥和水腫，使得膝關節粘連癥狀得以緩解[6]。在國外，針灸對骨關節炎的治療方式也備受關注。如在德國約有30 000個臨床醫師應用針灸療法緩解骨關節炎患者的疼痛感[7], 并且大量研究表明針灸治療骨關節炎起到了很好的效果[8]。然而針灸療法對軟骨細胞表型的具體影響并不明確。有研究推測，過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子1α(PGC-1α)的表達下降導致線粒體轉錄因子A(TFAM)表達降低和線粒體功能損害是骨關節炎發生的主要機制之一[9]。解耦聯蛋白(UCPs)是一類線粒體內膜上的載體，屬于線粒體載體超家族，可以將H+從線粒體內膜滲漏到線粒體基質中，減少ATP的合成并產生熱能，即解耦聯作用。目前已知的UCP包括 UCP 1、UCP 2、UCP 3、UCP 4、UCP 5等。UCP 2從1997年發現至今其在代謝方面的作用仍處于研究之中，就目前的研究表明，UCP 2在線粒體質子漏調節，減少線粒體氧自由基(ROS)產生，糖脂代謝方面都起到了一定的作用[10]。TFAM下游的UCP 2和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)是細胞內ROS生成的重要信號因子，而且ROS生成的增加會導致軟骨細胞表型的丟失[11]。因此, 本研究通過對大鼠體內膝眼穴針灸，期望明確針灸對軟骨細胞表型變化的影響，了解其參與線粒體生成ROS的PGC-1α信號通路的改變。

1 材料與方法

1.1 針灸動物模型制作 選擇8只24周齡SD大鼠，無菌級，♀♂不限。每只大鼠隨機選擇一側膝關節作為對照組，另一側作為針灸組。向大鼠膝關節髕骨尖端左右兩側凹陷處進針，每次進針30 min，每10 min運針1次，每周進行2次針灸，持續4周。

1.2 PGC-1α激活模型制作 選擇8只24周齡SD大鼠，♀♂不限。每只大鼠隨機選擇一側膝關節注射DMSO 10μl作為對照組，另一側注射濃度為100 mmol/L的PGC-1α激活劑 ZN005L 10μl作為實驗組。每周注射1次，持續4周。

1.3 免疫組化技術 將實驗大鼠脊椎脫臼法處死后取膝關節軟骨。室溫下石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片放入 10 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的電爐鍋內，鍋內的水沸騰開始計時 20 min，進行抗原修復，然后自然冷卻到室溫。山羊血清(1 ∶10)封閉非特異性染色，室溫孵育 15 min；然后分別加入一抗(兔抗鼠)col 1(1 ∶500)、col 2(1 ∶200)和aggrecan(1 ∶500)，4 ℃過夜；PBS 洗滌后加入二抗(羊抗兔，1 ∶1 000)，37 ℃孵育 20 min，再按試劑盒的說明書，鏈酶親合素-生物素- 酶復合物法處理，DAB 顯色，封片。熒光顯微鏡下拍照檢測。根據免疫組化評分標準(染色細胞數百分比參考分值+染色強度參考分值)進行評分。

表1 免疫組化評分標準

1.4 軟骨細胞體外培養 收獲SD大鼠膝關節軟骨,并進行胰蛋白酶/膠原酶消化分離軟骨細胞。用加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液 (Gibco),青霉素/鏈霉素 (0.1g/L) 和谷氨酰胺 (4.5 mmol) 的培養基進行體外培養。

1.5 細胞流式技術 向培養基中加入ZN005L 100 mmol/L(對照組加入DMSO)作用24 h后消化并收獲細胞,調整細胞濃度至(1～10)×109/L，裝載探針：加入濃度為10 mmol/L的 DCFH-DA,37℃ 5% CO2培養箱中靜置0.5 h，每隔 3～5 min 混勻一下，使探針和細胞充分作用；用無血清的培養基或溫暖的PBS液洗滌細胞3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA；收獲各組細胞,上流式細胞儀檢測ROS,激發光 488 nm,發射光 525 nm。

2 結果

2.1 針灸后大鼠膝關節軟骨細胞表型部分指標結果 與對照組比較，針灸組的大鼠膝關節軟骨細胞col 1(圖1A、B)和col 2(圖1C、D)的表達量并沒有發生顯著變化；而aggrecan(圖1E、F)的表達量發生了下降的趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1G。表明膝眼穴針灸療法對軟骨細胞表型并沒有促進作用，反而使得軟骨細胞表型出現了丟失的現象。

2.2 針灸后大鼠膝關節軟骨細胞中PGC-1α的表達結果 與對照組比較，針灸組的大鼠膝關節軟骨細胞內PGC-1α的表達顯著增高(圖2A、B)，而TFAM(圖2C、D)和UCP 2(圖3A、B)的表達發生了輕微的降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2E、3G。然而NOX 1/4的表達并沒有出現變化(圖3C～F)。這表明，雖然膝眼穴針灸的干預使得PGC-1α的表達增加，但是PGC-1α并沒有提高線粒體的功能，反而促使TFAM的表達量降低，導致線粒體功能下降，同時UCP 2表達下降造成解耦聯作用也受到損害。

圖1 膝眼穴針灸后，軟骨細胞表型主要指標aggrecan表達降低 Bar=100 μm，*P<0.05

圖2 膝眼穴針灸后PGC-1α表達升高，TFAM表達降低 Bar=100 μm,*P<0.05

2.3 激活PGC-1α的表達結果 向培養基內加入ZN005L激活PGC-1α的表達后發現， PGC-1α表達增加后軟骨細胞內ROS的生成量降低(圖4),并且col 1表達量降低，col 2和aggrecan表達量升高(圖5)，差異有統計學意義(P<0.05)。表明激活PGC-1α能夠通過降低軟骨細胞內ROS的生成量，進而抑制了軟骨細胞丟失的現象。

3 討論

本研究發現，膝眼穴針灸干預并沒有保持軟骨細胞表型的作用，反而會促進aggrecan表達的降低(圖1)。這說明膝眼穴針灸并未有效地改善軟骨細胞的功能，相反是破壞了軟骨細胞的功能。中醫理論中，針灸能夠緩解患者疼痛，促進血液循環消除腫脹，這可能說明部分穴位針灸療法只能改善膝骨關節炎的臨床癥狀，起到緩解的作用，但是并沒有從根本上使得軟骨細胞功能恢復到正常狀態。針灸療法能夠減弱疼痛感，消除腫脹感，但如果長期、反復應用針灸療法，骨關節炎的癥狀是否會進一步得到改善還需要長期的觀察與隨訪。

線粒體是ROS生成的主要細胞器。血管內皮發育與體內穩態學的相關研究表明，促進PGC-1α的表達能夠降低ROS的生成量[12-13]。本研究結果顯示，激活PGC-1α的表達能夠降低軟骨細胞內ROS生成量，進而抑制軟骨細胞表型丟失現象(圖4、5)。然而膝眼穴針灸干預后TFAM與UCP 2的表達卻發生降低。這表明雖然針灸能夠促進PGC-1α的表達，但同時也會使TFAM和UCP 2表達降低(圖2、3)。TFAM代表線粒體生物合成功能(如ATP的生成降低)，UCP 2能夠通過解偶聯作用降低ROS的生成量[14-15]。當進行針灸后TFAM表達量下降意味著線粒體的合成功能受損，UCP 2表達降低意味著線粒體解偶聯功能受損。而且有研究顯示，在膝骨關節炎患者的軟骨細胞中發現線粒體的功能也會發生下降。本研究中膝眼穴針灸干預促使軟骨表型部分指標表達下降，這也許和針灸能夠導致線粒體功能下降有一定的關系。

圖3 膝眼穴針灸后,UCP 2表達降低 Bar=100 μm,*P<0.05

圖4 激活PGC-1α的表達后，軟骨細胞內ROS生成量降低

圖5 激活PGC-1α的表達后軟骨細胞表型丟失現象被抑制 Bar=100 μm,*P<0.05

本次研究只探討了膝眼穴進行針灸療法后對軟骨細胞的影響，并沒有研究聯合其他穴位所產生的效果，由于動物模型數量有限，選取的針灸模型為成年SD大鼠，如果選擇制作關節炎大鼠模型進行針灸實驗，那么結果可能更加明顯并且意義更加深遠。同時此實驗缺少臨床實驗與隨訪調查使得本次研究具有一定的局限性,這需要在今后進一步完善。

[1] Sims N A, Martin T J.Coupling the activities of bone formation

and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit[J].Bonekey Rep,2014,3(4):481-482.

[2] Shuler F D, Conjeski J, Kendall D, et al.Understanding the burden of osteoporosis and use of the World Health Organization FRAX[J].Orthopedics,2012,35(9):798-805.

[3] Dy P, Wang W, Bhattaram P, et al.Sox9 directs hypertrophic maturation and blocks osteoblast differentiation of growth plate chondrocytes[J].Dev Cell,2012,22(3):597-609.

[4] Han Y, Lefebvre V.L-Sox5 and Sox6 drive expression of the aggrecan gene in cartilage by securing binding of Sox9 to a far-upstream enhancer[J].Mol Cell Biol,2008,28(16):4999-5013.

[5] Schulze-Tanzil G.Activation and dedifferentiation of chondrocytes: implications in cartilage injury and repair[J].Ann Anat, 2009,191(4):325-338.

[6] 彭之蓮，黃 劍.針灸治療膝關節骨性關節炎經穴研究[J].河南中醫，2008，28(7):104-105.

[7] St?r W, Irnich D.Acupuncture:Basics, practice, and evidence[J]. Anaesthesist,2009,58(3):311-323.

[8] 田力欣，王 衛，郭 義，等.國外針灸治療膝骨關節炎的隨機對照研究概覽[J].針灸臨床雜志，2010，26( 6):76-79.

[9] Wang Y, Zhao X, Lotz M, et al.Mitochondrial biogenesis is impaired in osteoarthritis chondrocytes but reversible via peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α[J].Arthritis Rheumatol,2015,67(8):2141-2153.

[10] Rudofsky G Jr，Schr?dter A，Voron′ko O E, et al. Promoter polymorphisms of UCP l，UCP 2，and UCP 3 are not associated with diabetic microvascular complications in type 2 diabetes[J].Horm Metab Res，2007,39(4):306-309.

[11] Mailloux R J, Harper M E.Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen species production[J].Free Radic Biol Med,2011,51(6):1106-1115.

[12] Olmos Y,Valle I,Borniquel S, et al.Mutual dependence of Foxo3a and PGC-1alpha in the induction of oxidative stress genes[J].J Biol Chem,2009,284(21):14476-14484.

[13] Kang C, Li J L. Role of PGC-1α signaling in skeletal muscle health and disease[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1271(1):110-117.

[14] Mailloux R J,Harper M E.Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen species production[J].Free Radic Biol Med,2011,51(6):1106-1115.

[15] Robson-Doucette C A, Sultan S, Allister E M, et al.Beta-cell uncoupling protein 2 regulates reactive oxygen species production, which influences both insulin and glucagon secretion[J].Diabetes, 2011,60(11):2710-2719.

(接收日期：2017-06-03)

Effect of acupuncture for the knee point on chondrocyte phenotype and PGC-1α signal pathway in knee

MIAOYan-song,XUQing-rong,LIHe,YAOJu-fang,DONGYu-qi

(DeptofOrthopaedics,RenjiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To study the effects of acupuncture for the knee point on the change of chondrocyte phenotype and the peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1 alpha (PGC-1α) signaling pathway involved in mitochondrial oxygen free radical (ROS). Methods The main indicators(col 1，col 2，aggrecan) of chondrocyte phenotype of the rat knee cartilage, PGC-1α, mitochondrial transcriptional factor A (TFAM), uncoupling protein 2(UCP 2) and NADPH oxidase1/4(NOX 1/4) were detected by immunohistochemical technique afer the knee joints of the rats were acupuncture for the knee point. Moreover, after ZN005L was injected into the knee joint of the rat to activate the expression of PGC-1α，the changes of chondrocyte phenotype and ROS were detected. Results The up-regulation of PGC-1α could inhibit the loss of chondrocyte phenotype and reduced the production of ROS. Although acupuncture for the knee point could increase the expression of PGC-1α, it reduced the mitochondrial function and the effect of the coupling,and leaded to the loss of chondrocyte phenotype. Conclusions Acupunture therapy can not improve the function of chondrocytes, on the contrary, it can promote the loss of chondrocyte phenotype and destroy the function of the chondrocytes.

acupuncture for the knee point;chondrocyte phenotype; PGC-1α;TFAM;UCP 2

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.04.046

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院骨科,上海 200127

苗巖松,男,碩士生,主要從事膝骨關節炎研究, E-mail:1104782332@qq.com; 徐卿榮,男,博士,主任醫師,碩士生導師,通訊作者,主要從事膝骨關節炎研究, E-mail:xuqingro@139.com

R 684.3

A

1008-0287(2017)04-0503-05