渤海不同區域沉積物古菌的多樣性分析

王炳臣, 鄭世玲, 張洪霞, 魏文超, 王歐美, 劉芳華

?

渤海不同區域沉積物古菌的多樣性分析

王炳臣1, 2, 鄭世玲1, 張洪霞1, 2, 魏文超1, 2, 王歐美3, 劉芳華1

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 海岸帶生物學與生物資源利用所重點實驗室, 山東煙臺 264003; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 濱州醫學院, 山東煙臺 264003)

產甲烷古菌在濱海沉積物碳循環過程中起著重要作用。本研究以渤海不同區域沉積物為研究對象, 通過T-RFLP以及室內富集培養方法, 解析了渤海不同區域沉積物產甲烷菌群落結構差異, 并評估其產甲烷潛力。結果表明, 渤海不同區域沉積物細菌和產甲烷古菌群落結構組成存在差異, 其主要優勢產甲烷菌為和, 主要優勢細菌為和。渤海不同區域沉積物在實驗室培養條件下產甲烷量存在明顯差異, 表現為近岸區域沉積物產甲烷量較高。且渤海沉積物具有較高的產甲烷潛力 (乙酸轉換率達到46.46 %), 潛在甲烷排放量估計值可達1.74億t/年。

甲烷; 渤海; 產甲烷菌; 多樣性; 產甲烷潛力

溫室效應是全球氣候變化的重要表現形式之一。甲烷(CH4)是全球第二大溫室氣體, 其增溫潛勢是CO2的21倍[1], 對大氣增溫貢獻率為17%, 研究CH4排放對衡量區域內溫室氣體的排放具有重要意義。全球甲烷排放量大約為每年500t, 其中74%由產甲烷菌產生[2-3]。產甲烷菌廣泛分布于海底及淡水沉積物、水稻田、動物胃腸道、地熱及地礦等自然環境中[4], 在全球碳循環中起到重要的作用; 其產甲烷途徑主要包括: 氫營養型[5], 乙酸營養型以及利用甲基類化合物的甲基途徑[6]。目前, 對甲烷排放的相關研究多集中在草原、水稻田、濕地、湖泊、河口等區域[5-10], 對于海洋沉積物的甲烷排放研究也相對較少。

海洋是大氣中CH4的自然排放源, 所釋放的CH4量為全球總釋放量的2%~4%[11], 其中占全球海洋面積16%的河口和近岸地區的釋放量約為全球海洋CH4總釋放量的75%[12]。通常, 由于河流中含有的高度過飽和CH4[13]被輸入近海區域, 且河流向近岸海域輸送大量陸源生物質, 為近海CH4產生提供有利環境條件。因此, 海洋不同區域CH4排放量存在差異, 在估算全球海洋釋放CH4量時有很大的不確定性。

渤海屬于我國內海, 具有半封閉、海床淺等特性, 是重要的自然漁場與資源礦場, 及重要的水上航線, 因此受到很多人為活動的影響[14-19]。此外, 環渤海區域河流較多, 近海區域受河流陸源性物質輸入更為突出, 因此, 分析比較渤海近岸區域、離岸區域以及黃渤海交匯區域沉積物產甲烷菌群落結構與產甲烷潛力具有重要的生態意義。

以往研究主要集中于渤海沉積物微生物多樣性, 微生物對渤海溢油降解等方面[20-23], 而對于渤海沉積物甲烷排放的相關研究則很少[24]。本研究通過對渤海不同區域產甲烷菌群落結構的分析及不同區域沉積物CH4排放潛力的評估, 有助于認識渤海區域甲烷代謝的微生物學機制, 同時為估算全球海洋CH4釋放量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品來源

沉積物樣品于2015年8月取自渤海內不同區域, 共12個位點: 黃河口近岸區域(BHB區域); 從渤海灣至遼東灣貫穿渤海區域(M區域), 樣點位于渤海內部; 渤海口與黃海交互作用區域(E區域, 圖1)。采用抓斗式取樣器采集海洋沉積物后, 取0~5 cm表層沉積物樣品, 混合均勻后, 一部分保存于4℃, 用于海水富集培養; 另一部分–80℃冷凍保存, 用于沉積物理化性質測定及微生物多樣性分析。

1.2 沉積物理化性質的測定

沉積物硝態氮、銨態氮采用2 mol/L KCl(土水比1︰5) 浸提, 用自動分析儀分析 (AutoAnalyzer III, Seal, Germany)分析測定; 硫酸鹽 (SO42–) 用去離子水 (土水比1︰10,/) 提取, 用自動分析儀 (Dionex ICS3000, DIONEX, America)測定; pH值采用去離子水 (土水比1︰2.5,/) 浸提15 min后用pH計 (PH-3C, 上海雷磁, 中國)測定。

可提取態Fe(II)濃度的采用紫外菲啰嗪(Ferrozin)顯色法測定[25]: 稱取0.5 g沉積物加入到4.5 mL的0.5 mol/L鹽酸中, 室溫條件下黑暗靜置24 h。8 000 r/min離心5 min, 取上清0.1 mL, 加入1.9 mL含0.1% 菲啰嗪的200 mmol /LHEPES緩沖液, 反應5 min, 在562 nm波長下測定吸光值, 根據標準曲線計算Fe(II)濃度。每個樣品重復3次。

1.3 DNA提取及T-RFLP分析

沉積物樣品DNA采用FastDNATMSPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) 試劑盒提取, 具體操作參照說明書標準流程。參考Zheng等的方法進行T-RFLP分析[26], 以DNA為模版, 細菌引物為 Ba27f/Ba907r, 古菌引物為Ar109f/Ar915r進行PCR擴增。其中引物Ba27f的5′端和Ba907r的3′端標記6-羧基熒光素 (FAM)。PCR反應參數為: 94℃ 2 min預變性; 94℃變性30 s; 溫度55℃ 30 s退火; 溫度72℃ 1 min延伸, 反應25個循環。PCR產物經純化后, 古菌DNA采用TaqI酶進行酶切, 細菌DNA采用MspI酶進行酶切, 酶切產物采用自動測序儀ABI PRISM 3730XL分析。

1.4 沉積物富集培養

沉積物富集培養: 采用海水富集培養基 (NH4Cl 1.5g/L, NaH2PO40.6 g/L, NaCl 11.7 g/L, NaHCO32.5 g/L, CaCl2·2H2O 0.1 g/L, KCl 0.1 g/L, MnCl2·4H2O 0.005 g/L, Na2MoO4·2H2O 0.001 g/L, MgCl2·6H2O 0.1 g/L, MgSO4·7H2O 0.1 g/L, CH3COONa 2.7 g/L, 酵母提取物 0.05 g/L)[27], 以33 mmol/L乙酸為電子供體進行富集培養。培養基分裝至100 mL的西林瓶中, 每瓶40mL, 充入混合氣(N2: CO2, 80 : 20)30 min, 密封。培養基通過高壓滅菌鍋, 121℃, 0.15 MPa滅菌20 min,冷卻至室溫后置于厭氧操作臺進行接種, 采用無菌注射器向每瓶加入0.5 g沉積物的懸浮液, 并設置無沉積物的純培養基作為對照, 置于適合產甲烷古菌的30℃黑暗條件, 靜置培養。

富集培養期間, 每隔5 d用無菌注射器分別抽取氣體和液體樣品, 用配備FID檢測器的氣相色譜 (Agilent 7890A) 測定甲烷產量, 若樣品中CH4濃度過高時, 則用N2稀釋后測定。甲烷氣相色譜檢測方法: 用H2、N2和CO2為保護氣, 以濃度為400×10–6的甲烷為標氣。設置前檢測器為250℃, 后檢測器為330℃, 設置柱溫箱為75℃, 后進樣口溫度為375℃, 點火完畢后使用FID檢測器檢測, CH4出峰時間約為1.3 min。用高效液相色譜 (Agilent 1260 Infinity Quaternary LC) 測定乙酸濃度, 用注射器 (無菌) 抽取1 mL液體樣品10 000 r/min離心2 min, 取上清稀釋, 過0.22mm孔徑濾膜后上機檢測。

1.5 數據分析

本研究中T-RFs片段所代表的屬水平上的細菌或古菌的鑒定參照文獻及課題組研究濱海濕地樣品所建的細菌和古菌克隆文庫[26,28], 并使用Greengene進行BLAST比對。利用軟件CANOCO 4.5(蒙特卡洛檢驗, 基于499個隨機非限制排列)進行微生物群落結構與環境因子之間相關性的RDA分析, 以及做微生物群落結構組成的PCA分析。微生物T-RFs片段多樣性, 用香農威納指數(Shannon Wiener, H= –SPilnP式中P=N/,N為種的個體數,為所在群落的所有物種的個體數之和) 計算并表示。采用Sigmaplot 12.5軟件對產甲烷和乙酸消耗數據進行分析。通過實驗結果, 估算渤海區域產甲烷潛力: 渤海區域產甲烷潛力估算值=渤海區域面積×渤海平均深度×實驗室乙酸濃度×實驗室中乙酸產甲烷最大轉換率。

2 結果與分析

2.1 沉積物的理化性質

如表1所示, 3個區域所有站位沉積物pH值均呈堿性 (7.5~9.0)。BHB區域樣品的pH相對較低; M區域各位點樣品pH (8.5~8.7) 略高, 且相對穩定; 導電率相對較高; E區域位點樣品pH值介于7.5~9.0, 變化相對較大; 電導率相對較低, 而銨態氮含量相對較高, 硝態氮含量較低。

2.2 渤海沉積物微生物多樣性

如圖2所示, 渤海不同區域沉積物優勢古菌T-RFs片段均為86、181和388 bp。此外, E區域站位樣品古菌T-RFs片段還包括197、221 bp; 而M區域各位點樣品古菌T-RFs片段還包括197 bp和304 bp。說明渤海不同區域沉積物樣品主要古菌群落相同, 同時存在區域性多樣性的差異。

表1 不同站位沉積物理化性質(平均值±標準誤差)

參照已建克隆文庫, 各T-RFs片段代表的屬水平上的古菌見表2。可知, 渤海沉積物共有的優勢古菌T-RFs片段86 bp和181 bp分別代表甲烷桿菌屬()和甲烷八疊球菌屬(), 而其他T-RFs片段代表未知古菌。

由圖2 (b)可知, 渤海不同區域沉積物細菌群落結構存在明顯差異。細菌T-RFs 片段160、490和505 bp 為渤海不同區域沉積物樣品的主要優勢片段, 與M區域的主要優勢細菌片段相同; E區域樣品細菌T-RFs片段還包括91 bp和113 bp; BHB6樣品細菌T-RFs片段還包括91、113、128、435和446 bp, 其中BHB區域代表片段多樣性的Shannon指數為1.44~2.56, 相比其他區域, 細菌多樣性最高。說明結果與古菌相類似, 渤海不同區域沉積物樣品存在區域性多樣性的差異。

各T-RFs 片段代表的屬水平上的細菌見表3。160 bp和490 bpT-RFs 片段分別為脫硫弧菌屬()和硫桿菌屬 (); 此外, 91, 113, 128和435 bp T-RFs片段分別代表擬桿菌屬 (), 脫氯菌屬(), 副球菌屬()和鞘氨醇單胞菌屬 ()。其他T-RFs片段代表細菌未知。

表2 采用限制性內切酶Taq I產生的古菌片段構建克隆文庫的16S rRNA基因系統發育關系

注: a為用Greengene進行BLAST比對的結果, b為限制性內切酶I切割后的T-RF片段長度

表3 采用限制性內切酶MspI產生的細菌片段構建克隆文庫的16S rRNA基因系統發育關系

注: a為用Greengene進行BLAST比對的結果, b為限制性內切酶I切割后的T-RF片段長度

2.3 渤海沉積物微生物群落結構的主成分分析(PCA)

為了進一步分析渤海不同區域沉積物微生物群落結構組成變化, 對12個位點樣品微生物群落結構做主成分分析。結果如圖3所示, 除M5與E0聚集在一起外, 其他位點沉積物微生物群落結構具有明顯差異。相同區域范圍的不同位點樣品微生物群落組成也表現出明顯差異, 說明渤海不同位點沉積物樣品的微生物群落結構存在較大差異, 具有較高的微生物多樣性。

2.4 沉積物微生物群落結構與環境因子相關性分析

為了探究影響渤海沉積物微生物群落結構的環境因素, 對渤海沉積物細菌和古菌群落結構與環境因子之間分別做冗余分析(RDA)。結果顯示(如圖4a), 總鐵、Fe(II)、電導率、pH、銨態氮、硫酸鹽共6個變量組合, 能夠保證所有變量膨脹系數都小于4, 其中硫酸鹽解釋量最高為15.5%, 總鐵解釋量最低為9.3%, 4個變量的前兩個軸共解釋了38.5%的古菌T-RFs片段變化, 約73.1%的群落-環境關系。BHB和E區域樣品古菌群落主要受銨態氮影響, 而M區域中M5、M8、M9、M11四個位點樣品古菌群落結構主要受硫酸鹽和Fe(II)影響。T-RFs 221bp和388bp代表的古菌群落與銨態氮呈正相關; T-RFs 197bp和 304bp代表的古菌群落與pH、EC和Fe(II)呈正相關; 181bpT-RFs與硝態氮和亞硝態氮呈正相關。

散點圖是主坐標1 (PC1)與主坐標2 (PC2)。樣品的變化百分比如圖中所描述的在軸上顯示

The scatterplot is of principal coordinate 1 (PC1) as a function of principal coordinate 2 (PC2); The percentage of the variation in the samples described by the plotted PCs is shown on the axes

如圖4b所示, 總鐵解釋量最高為32.4%, pH解釋量最低為5.35%, 四個變量的前兩個軸共解釋了55.5%的細菌T-RFs片段變化, 約92.4%的群落-環境關系。可提取態總鐵(TFe)是影響渤海沉積物細菌群落結構的顯著環境變量(<0.05)。M1、M9、E2和E4位點細菌群落結構與pH和硫酸鹽呈正相關; BHB6、E0和E7位點細菌群落結構與Fe(II)和TFe呈正相關。

2.5 渤海不同區域沉積物產甲烷量的變化

由圖5可知, 在整個富集培養期間中 (0~40 d), 對照 (CK) 處理沒有CH4產生, 而渤海不同區域沉積物樣品產CH4量具有明顯差異。在培養的0~15 d, 所有沉積物富集樣品中均沒有甲烷產生; 在培養的第20天以后, 所有樣品開始產生CH4并積累。BHB8樣品最先產生CH4且含量迅速上升, 在第25天達到最大值0.62 mmol, 之后保持相對穩定, 其產甲烷速率為1.5 mmol/d; BHB6樣品在第25天后甲烷產量迅速上升, 在第35天達到最大值0.58 mmol。E4樣品在第25天后甲烷產量也迅速上升, 在第35天達到最大值0.56 mmol; 而E區域中其他樣品產甲烷量相對較少。M區域的M1、M8和M11樣品在第25天后產CH4量迅速上升, M1在第30 天達到最大值0.59 mmol, 之后保持相對穩定, M8和M11樣品在第35天分別達最大值0.60 mmol和0.65 mmol。

在整個培養期間 (0~40 d), 乙酸作為底物被消耗與CH4產量基本相對應。對照 (CK) 處理乙酸含量基本保持33 mmol/L不變。BHB6和BHB8樣品乙酸含量在第20天后開始逐漸下降, BHB6在第40天乙酸被全部利用, BHB8的乙酸含量在第40 天下降為13.92 mmol/L。在培養的第30天, E4樣品的乙酸就被消耗完, 而E區域其他樣品在培養的最后乙酸含量均小幅降低。M1和M11樣品的乙酸含量分別在第35、40天降低為0 mmol/L, M區域其他樣品在培養的最后乙酸含量也均小幅降低。說明渤海不同區域沉積物樣品利用乙酸為底物產CH4的情況不同, 雖然所有沉積物樣品具有相同的優勢產甲烷菌。E4樣品細菌和古菌群落結構及產甲烷量都明顯不同于E區域其他樣品, 說明渤海沉積物微生物群落結構及功能具有區域特異性。通過由乙酸產甲烷 (CH3COOH→CH4+CO2) 計算發現, 最大轉換率為46.46%。

3 討論

根據底物利用類型, 產甲烷菌可分為3類: (1)乙酸營養型, 如甲烷鬃毛菌屬(); (2)氫營養型, 主要利用H2和甲酸作為電子供體還原CO2產生甲烷, 如甲烷桿菌屬(); (3)甲基化營養型, 通過H2還原甲基化合物中的甲基產甲烷或通過甲基化合物自身的歧化作用產甲烷, 如產甲烷球菌屬()。海洋和濱海濕地鹽度和硫酸鹽含量較高, 而鹽度和硫酸鹽影響競爭性電子和產甲烷底物的種類和含量, 對產甲烷菌群落結構和甲烷產生途徑有重要影響[29]。3種營養型的產甲烷菌廣泛分布于淡水環境、濱海濕地和海洋沉積物中。Liu等[30]研究發現太湖沉積物中優勢古菌為Metha-no-microbiales目和Methanosarcinaceae科的產甲烷菌,而閩江河口區短葉茳芏潮汐淡水沼澤濕地土壤主要優勢產甲烷菌為、和[9];、和為東海油氣田沉積物的主要產甲烷菌。與以往研究類似[33], 本研究中沉積物主要優勢古菌為產甲烷菌和, 分別為氫營養型和乙酸營養型[32], 而兼性菌還能夠利用甲胺類產甲烷。因此, 渤海沉積物中3種類型有機底物都能夠被利用而產生甲烷。

Baldwin等[34]對淡水濕地研究發現, 隨著添加鹽度的增加, 土壤中產甲烷菌群落多樣性降低。Jenifer 等[35]對添加海水的淡水濕地的研究發現, 細菌和古菌的群落結構均沒有隨著鹽度的增加而改變。在渤海沉積物中產甲烷菌群落結構與鹽度沒有顯著相關性, 本研究中也沒有發現顯著影響海洋沉積物古菌多樣性的環境因子, 所以站點與環境因子種類的增加是該區域進一步研究的重點。

本研究中近海沉積物樣品產甲烷速率較快, 可能由于海洋沉積物中甲烷的產生速率在很大程度上受限于可降解有機質的含量[36], 而在近海區域受河流攜帶大量懸浮物和有機物的沉積, 使該海域沉積物中有機碳含量較高, 產甲烷菌活性較強。根據室內富集培養產甲烷量, 本研究對渤海最大產甲烷潛力進行了估算: 渤海平均深度為18 m[37], 總面積為7.7萬km2[38], 按照實驗室中乙酸濃度 (33 mmol/L) 與轉化率 (46.46%) 計算, 整個渤海年甲烷產生潛力約為17.4億t, 小于很多濕地環境中甲烷產生量[39-41], 可能由于海洋沉積物產甲烷底物含量低且存在更高濃度的產甲烷的競爭電子受體, 如硫酸鹽、硝酸鹽以及鐵錳氧化物[42-44]。但本研究估算值大于李佩佩等的夏季估算值360~930 t[24], 這可能由于渤海海域有機酸輸入小于實驗輸入值, 甲烷氧化與溶解等原因[46]。但同時說明渤海產甲烷潛力巨大 (17.4億t/年), 隨著陸源輸入及人為活動的影響, 甲烷排放可能進一步升高。

4 結論

渤海不同區域沉積物細菌和產甲烷古菌群落結構組成存在差異。可提取態總鐵對細菌群落結構具有顯著影響,和為渤海沉積物主要優勢細菌。渤海沉積物主要優勢產甲烷菌為和。渤海不同區域沉積物產甲烷量具有明顯差異, 表現為近岸區域沉積物產甲烷量較高。且渤海沉積物具有較高的產甲烷潛力 (乙酸轉換率達到46.46 %), 潛在甲烷排放量估計值可達1.74 億t/年。

[1] Manne A S, Richels R G. An alternative approach to establishing trade-offs among greenhouse gases[J]. Nature, 2001, 410(6829): 675-677.

[2] Lowe D C. Global change: A green source of surprise[J]. Nature. 2006, 439(7073): 148-149.

[3] 王雅蘋, 史曉翀, 于少蘭, 等. 青島潮間帶沉積物可培養厭氧細菌多樣性的研究[J]. 海洋科學, 2015, 39(3): 92-99. Wang Yaping, Shi Xiaochong, Yu Shaolan, et al. Diversity of culturable anaerobic bacteria isolated from intertidal sediments of Qingdao[J]. Marine Sciences, 2015, 39(3): 92-99.

[4] Huber R, Kurr M, Jannasch H W, et al. A novel group of abyssal methanogenic archaebacteria (methanopyrus) growing at 110-degrees-c[J]. Nature, 1989, 342(6251): 833-834.

[5] 鄭燕, 賈仲君. 新一代高通量測序與穩定性同位素示蹤DNA/RNA技術研究稻田紅壤甲烷氧化的微生物過程[J]. 微生物學報, 2013, 2: 173-184. Zheng Yan, Jia Zhongjun. Next generation sequencing and stable isotope probing of active microorganisms responsible for aerobic methane oxidation in red paddy soils[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2013, 2: 173-184.

[6] 張堅超, 徐鐿欽, 陸雅海. 陸地生態系統甲烷產生和氧化過程的微生物機理[J]. 生態學報, 2015, 20: 6592-6603. Zhang Jianchao, Xu Yiqin, Lu Yahai. Microbial mechanisms of methane production and oxidation in terrestrial ecosystems[J]. Acta Ecologica Sinica, 2015, 20: 6592-6603.

[7] 劉鵬飛. 甲烷胞菌對低氫和互營生長在轉錄水平的響應[D]. 北京: 中國農業大學, 2014. Liu Pengfei. Transcriptional responses of Methanocella methanogens to low H2and syntrophic growth conditions[D]. Beijing: China Agricultural University, 2014.

[8] 許可, 陳金全. 九龍江口海岸帶沉積物甲烷相關古菌群落結構及多樣性研究[J]. 安徽農業科學, 2012, 26: 12752-12753. Xu Ke, Chen Jinquan. Stratified Communities and Diversity of Methanogen in Sediments of Jiulong River Estuary[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2012, 26: 12752-12753.

[9] 曾志華, 楊民和, 佘晨興, 等. 閩江河口區淡水和半咸水潮汐沼澤濕地土壤產甲烷菌多樣性[J]. 生態學報, 2014, 10: 2674-2681. Zeng Zhihua, Yang Minhe, She Chenxing, et al. Diversity of methanogen communities in tidal freshwater and brackish marsh soil in the Min River estuary[J]. Acta Ecologica Sinica, 2014, 10: 2674-2681.

[10] 俎千惠, 王保戰, 鄭燕, 等. 我國8個典型水稻土中產甲烷古菌群落組成的空間分異特征[J]. 微生物學報, 2014, 54(12): 1397-1405. Zu Qianhui, Wang Baozhan, Zheng Yan, et al. Spatial shifts in methanogenic archaeal community composition in eight Chinese paddy soils[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(12): 1397-1405.

[11] Houghton J E T, Ding Y H, Griggs J, et al. IPCC 2001. Climate Change 2001: the scientific basis[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2001: 227-239.

[12] 趙玉川, 張桂玲, 劉素美. 2009年8月底長江口海水中甲烷的分布與釋放通量[J]. 海洋科學, 2011, 35(11): 81-89. Zhao Yuchuan, Zhang Guiling, Liu Sumei. Distribution and fluxes of methane at Changjiang (Yangtze River) Estuary at the end of August 2009[J]. Marine Sciences, 2011, 35(11): 81-89.

[13] Angelis M A, Scranton M L. Fate of methane in the Hudson River and Estuary[J]. Global Biogeochemical Cycles, 1993, 7(3): 509-524.

[14] 王震, 李宜良, 趙鵬. 環渤海地區海洋漁業經濟可持續發展對策研究[J]. 中國漁業經濟, 2015, 33(1): 38-43. Wang Zhen, Li Yiliang, Zhao Peng. A Study on the Countermeasures of Sustainable Development of Bohai Marine Fishery Economy[J]. Chinese Fisheries Economics, 2015, 33(1): 38-43.

[15] 吳莉, 侯西勇. 2000~2010年環渤海省市海岸帶土地利用變化分析[J]. 海洋科學, 2015, 39(9): 101-110. Wu Li, Hou Xiyong. Analysis of land use change in the coastal zone of Circum the Bohai Sea Region during 2000 to 2010[J]. Marine Sciences, 2015, 39(9): 101-110.

[16] 宋文博, 孔俊莉, 王國向. 對渤海漁業資源衰減的思考與建議[J]. 齊魯漁業, 2015, 5: 47-48. Song Wenbo, Kong Junli, Wang Guoxiang. Thoughts and Suggestions on the Attenuation of Fishery Resources in Bohai Sea[J]. Shandong Fisheries, 2015(5): 47-48.

[17] 王鋼, 喬延龍. 渤海灣漁業資源面臨的問題及其養護工作的建議[J]. 港口經濟, 2012, (9): 52-53. Wang Gang, Qiao Yanlong. The Suggestions about the Problems in Fishery Resources and Maintenance Work in Bohai Bay[J]. Port Economy, 2012(9): 52-53.

[18] 徐海龍, 谷德賢, 喬秀亭, 等. 渤海灣主要漁業資源長度與體質量關系分析[J]. 南方水產科學, 2014, 10(1): 57-63. Xu Hailong, Gu Dexian, Qiao Xiuting, et al. Analysis of length-weight relationship for major fishing species from Bohai Bay[J]. South China Fisheries Science, 2014, 10(1): 57-63.

[19] 王曉磊, 馮秀麗, 劉瀟, 等. 冬、夏季渤黃海表層沉積物粒度特征差異及其成因分析[J]. 海洋科學, 2015, 39(8): 63-69. Wang Xiaolei, Feng Xiuli, Liu Xiao, et al. Particle size differences of surface sediments in the Bohai Sea and the Yellow Sea between winter and summer and the genetic analysis[J]. Marine Sciences, 2015, 39(8): 63-69.

[20] 王文興, 孫修勤, 牟敦彩, 等.渤海石油降解微生物某些生態學特征的調查研究[J]. 海洋環境科學, 1983, (4): 11-24. Wang Wenxing, Sun Xiuqin, Mu Duncai, et al. Investigation of some Ecological Characteristics of Oil Degrading Microorganisms in Bohai Sea[J]. Marine Environmental Science, 1983(4): 11-24.

[21] 高小玉, 樊景鳳, 陳佳瑩, 等. 大連“7.16”溢油事故對海洋石油烴降解菌和異養細菌豐度的影響[J]. 海洋環境科學, 2013, (5): 688-692. Gao Xiaoyu, Fan Jingfeng, Chen Jiaying, et al. Influence on marine hydrocarbon-degradating bacteria and heterotrophic bacteria abundance by Dalian “7.16” oil spill accident[J]. Marine Environmental Science, 2013, (5): 688-692.

[22] 孫修勤, 張進興, 盧穎. 渤海單菌株石油微生物降解芳烴的實驗室研究[J]. 海洋科學進展, 1987, (1): 37-47. Sun Xiuqin, Zhang Jinxing, Lu Ying, Experiment on Degradation of Aromatic Hydrocarbons by Microorganisms from the Bohai Sea[J]. Advances in Marine Science, 1987, (1): 37-47.

[23] 蘇園園, 丘仲鋒, 張艷萍. 遼東灣水體吸收系數區域性半分析反演算法[J]. 海洋科學, 2015, 39(4): 73-82. Su Yuanyuan, Qiu Zhongfeng, Zhang Yanping. A regional semi-analytical algorithm to retrieve absorption coefficients in the Liaodong Bay[J]. Marine Sciences, 2015, 39(4): 73-82.

[24] 李佩佩. 黃河口及黃、渤海溶存甲烷和氧化亞氮的分布與釋放通量[D].青島: 中國海洋大學, 2010. Li Peipei. Methane and Nitrous oxide in the Yellow River Estuary, The Yellow Sea and the Bohai Sea[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2010.

[25] Jaisi D P, Dong H, Kim J, et al. Nontronite particle aggregation induced by microbial Fe(III) reduction and exopolysaccharide production[J]. Clays & Clay Minerals, 2007, 55(55): 96-107.

[26] Zheng S, Zhang H, Li Y, et al. Co-occurrence of Methanosarcina mazei and Geobacteraceae in an iron (III)-reducing enrichment culture[J]. Frontiers in microbiology, 2015, 6: 941.

[27] Lovley D R, Phillips E J P. Organic Matter Mineralization withReduction of Ferric Ironin[J]. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(4): 683-689.

[28] 李瑩, 鄭世玲, 張洪霞, 等. 產甲烷分離物中Clostridium spp.與Methanosarcina barkeri潛在的種間直接電子傳遞[J]. 微生物學通報, 2017, 44(3): 591-600. Li Ying, Zheng Shiling, Zhang Hongxia, et al. Potential direct interspecies electron transfer (DIET) from Clostridium spp. to Methanosarcina barkeri in a methanogenic isolation [J]. Microbiology China, 2017, 44(3): 591-600.

[29] 王潔, 袁俊吉, 劉德燕, 等. 濱海濕地甲烷產生途徑和產甲烷菌研究進展[J]. 應用生態學報, 2016, 27(3): 993-1001. Wang Jie, Yuan Junji, Liu Deyan, et al. Research progresses on methanogenesis pathway and methanogens in coastal wetlands [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2016, 27(3): 993-1001.

[30] Liu F H, Lin G H, Gao G, et al. Bacterial and archaeal assemblages in sediments of a large shallow freshwater lake, Lake Taihu, as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 106(3): 1022-1032.

[31] 田琪, 王佳, 范曉蕾, 等. 海洋油氣田沉積物產甲烷活性及微生物生態[J]. 環境科學, 2014, 35(6): 2322- 2327. Tian Qi, Wang Jia, Fan Xiaolei, et al. Methanogenic Activity and Methanogen Diversity in Marine Gas Field Sediments[J]. Environmental Science, 2014, 35(6): 2322-2327.

[32] Narrowe A B, Angle J C, Daly R A, et al. High-resolution sequencing reveals unexplored archaeal diversity in freshwater wetland soils.[J]. Environmental Microbiology, 2017.

[33] Baldwin D S, Rees G N, Mitchell A M, et al. The short-term effects of salinization on anaerobic nutrient cycling and microbial community structure in sediment from a freshwater wetland[J]. Wetlands the Journal of the Society of the Wetland Scientists, 2006, 26(2): 455- 464.

[34] Edmonds J W, Weston N B, Joye S B, et al. Microbial Community Response to Seawater Amendment in Low-Salinity Tidal Sediments[J]. Microbial Ecology, 2009, 58(3): 558-568.

[35] Cynar F J, Yayanos A A. Enrichment and characterization of a methanogenic bacterium from the oxic upper layer of the ocean[J]. Current Microbiology, 1991, 23(2): 89-96.

[36] 李德生. 渤海灣及沿岸盆地的構造格局[J]. 海洋學報, 1980, (4): 93-101. Li Desheng. The Tectonic Frameworkers of Bohai Gulf and Coastal Basins[J]. China. Acta Oceanologica Sinica, 1980, (4): 93-101.

[37] 宋以柱. 中國黃海、渤海DMS和DMSP的濃度分布及影響因素研究[D].青島: 中國海洋大學, 2014. Song Yizhu. Studies on the Distribution of DMS and DMSP and Influencing Factors in the Yellow Sea and Bohai Sea[D]. qingdao: Ocean University of China, 2014.

[38] Keppler F, Hamilton JTG, Brass M, et al. Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions. Nature, 2006, 439(7073): 187-191.

[39] 郝慶菊, 王躍思, 江長勝, 等. 濕地甲烷排放研究若干問題的探討[J]. 生態學雜志, 2005, 24(2): 170-175. Hao Qingju, Wang Yuesi, Jiang Changsheng, et al. A review on methane emission from wetlands[J]. Chinese Journal of Ecology, 2005, 24(2): 170-175.

[40] Munger J W. Atmospheric Methane Its Role in the Global Environment: Khalil M A K (Ed.), Springer- Verlag, Berlin, ISBN 3-540-65099-7[J]. Agricultural & Forest Meteorology, 2004, 122 (1-2): 125-126.

[41] 古麗. 渤、黃、東海沉積物中硫化物的研究[D]. 中國海洋大學, 2011. Gu Li. The study of Sulfide in the Sediment of the Bohai, Yellow and East China Seas[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2011.

[42] 張經, 劉敏光, 陳長景, 等. 渤海灣沉積物中若干重金屬的存在形式[J]. 海洋學報, 1987, 9(4): 520-524. Zhang Jing, Liu Minguang, Chen Changjing, et al. Forms of several heavy metals in sediments of Bohai Bay[J]. Acta Oceanologica Sinica, 1987, 09(4): 520-524.

[43] 石強, 陳江麟, 李崇德. 渤海硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮季節循環分析[J]. 海洋通報, 2001, 20(6): 32-39. Shi Qiang, Chen Jianglin, Li Chongde. Seasonal Cycle Analysis of the Nitrate Nitrogen and Nitrite Nitrogen in the Bohai Sea[J]. Marine Science Bulletin, 2001, 20(6): 32-39.

[44] 王金良, 李慧鳳. 波浪以增大交換面積的方式影響海-氣通量[J]. 海洋科學, 2015, 39(1): 79-83. Wang Jinliang, Li Huifeng. Effect of wave on air-sea flux via magnifying the exchange area [J]. Marine Sciences, 2015, 39(1): 79-83.

Diversity of archaea in the sediments from different areas of the Bohai Sea

WANG Bing-chen1, 2, ZHENG Shi-ling1, ZHANG Hong-xia1, 2, WEI Wen-chao1, 2, WANG Ou-mei3, LIU Fang-hua1

(1. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resources Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

Methanogens play an important role in the carbon cycle of coastal sediments. In this study, sea water enrichment cultures with acetate as the substrate were employed to enrich methanogens using sediments of the Bohai Sea. The methane production was used to estimate potential methane productivity and terminal restriction fragment length polymorphism analysis was used to analyze the diversity of microbial communities simultaneously. Our results revealed that changes in the bacterial and the methanogens community structures in sediments from different areas of the Bohai Sea were found. The dominant methanogens wereandin sediments of the Bohai Sea, andandwere the dominant bacteria. Different areas of the Bohai Sea obviously varied on methane production, which shows that the methane emission is higher in the coastal area. Bohai Sea has great potential for methane productivity and acetic acid conversion rate (46.46%), and the estimation of potential methane production is 1.74 Gt per year.

methane; Bohai Sea; methanogens; diversity; potential methane productivity

(本文編輯: 梁德海)

[National Natural Science Foundation of China, No. 41371257, No.41573071, No.41401285, No.31600370; The Key Program, No. KZZD- EW-14; Hundred Talents Program (A) of the Chinese Academy of Sciences]

Dec. 12, 2016

Q936

A

1000-3096(2017)05-0008-09

10.11759/hykx20161024002

2016-12-12;

2017-02-07

國家自然科學基金面上項目(41371257、41573071)、國家自然科學基金青年項目(41401285、31600370), 中國科學院重點部署項目(KZZD-EW-14); 中國科學院百人計劃經費資助項目(A類)

王炳臣(1989-), 男, 河北景縣人, 博士研究生, 主要從事渤海沉積物微生物生態研究, 電話: 0535-2109269, E-mail: bcwang@yic.ac.cn;劉芳華, 通信作者, 研究員, 電話: 0535-2109268, E-mail: fhliu@yic.ac.cn; 王歐美, 通信作者, 副教授, 電話: 0535-6913374, E-mail: ziou79@ hotmail.com