利用微透析技術研究美羅培南在正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率

郭松喜 王英 劉春生 周靜超 張睢揚 王丹

·論著·

利用微透析技術研究美羅培南在正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率

郭松喜1，2王英2劉春生3周靜超4張睢揚2王丹4

目的探討美羅培南微透析探針在正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率。方法隨機將大鼠分為兩組：假手術組(1只)和膿毒癥組(3只)。分別將探針置入大鼠的皮膚、肌肉、血管及肺部，收集樣品，測定不同部位的回收率。結果對于所研究的靶部位(肺、血管、皮膚及肌肉)，正常大鼠回收率分別為30.14%±7.62%、26.20%±0.14%、25.90%±1.28%、13.95%±0.32%，膿毒癥大鼠回收率分別為46.43%±1.50%、45.96%±1.78%、33.93%±0.39%、39.48%±2.38%。美羅培南在正常大鼠所研究靶部位的回收率均低于膿毒癥大鼠靶部位的回收率，對于正常大鼠及膿毒癥大鼠在研究的靶部位中均是肺部回收率最高。結論美羅培南為高蛋白結合率藥物，肺部蛋白含量低，而美羅培南肺部吸收最少，出現肺部回收率最高的現象。通過微透析技術研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率，可推算出不同靶部位的藥物濃度。

美羅培南； 微透析； 膿毒癥大鼠； 體內回收率

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，盡管近年來抗生素治療取得了新的進展，但膿毒癥病死率仍呈現不斷上升的趨勢[1]。究其原因是難以對膿毒癥靶部位抗生素濃度進行動態觀察及準確捕獲，限制了對膿毒癥抗生素治療作用的深入研究。因此，本研究擬通過微透析研究美羅培南微透析探針在正常大鼠和膿毒癥大鼠體內的回收率[2-5]，為研究美羅培南在膿毒癥大鼠靶部位的藥物濃度奠定基礎[6]。

材料與方法

一、實驗試劑與藥品

美羅培南(中國藥品生物制品檢定所，生產批號：130506-200702)；復方氯化鈉溶液(華潤雙鶴藥業股份有限公司，批號：D201407171)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，批號：1405041503-B)；水為三蒸水(火箭軍總醫院制劑室自制)，丙二醇(分析純，北京化工廠，批號20140515)；

實驗動物：4只SD大鼠(200～300 g，雄性，購自北京維通利華有限公司)

二、實驗儀器

主要儀器：3200Q-Trap型MS/MS儀，美國 Applied Biosyetem公司；Agilent 1100 HPLC系統，美國Agilent公司；微透析體內外實驗操作臺(ZL 2014 208593710)，火箭軍總醫院；CMA30線性探針、CMA20血管探針、CMA470冷卻微量收集器和注射器 ，瑞典CMA公司；動物保溫墊，上海奧爾科特生物科技有限公司；AG285型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；DL-720A超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；DF101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 ，鄭州鞏義市予華儀器有限責任公司；XH-C渦旋混合器，江蘇金壇市白塔新寶儀器廠；PARAFILM封口膜，美國Bemis公司。

手術器械：眼科剪；血管鉗；彎鑷；三棱針；顯微鑷；4號絲線；紗布；棉球；2.5 ml注射器；

三、實驗步驟

1. 將4只SD雄性大鼠隨機分為兩組，假手術組1只，膿毒癥組3只。用3%戊巴比妥鈉(0.3 ml/100 g，ip)麻醉，專用眼科剪除去頸部、胸部、腹部及大腿毛發，將大鼠腹部朝上固定于保溫墊上，使其體溫保持在37.5 ℃左右。氣管插管，接呼吸機。

2. 分別將線性探針插入皮膚及肌肉組織，血管探針插入頸內靜脈及肺組織，然后將血管探針以1%的肝素鈉為灌注液，以2 μl/min的速度灌注15 min。在腹正中開腹，找到盲腸，從盲腸遠端1 cm處結扎盲腸，用中號圓針帶7-0絲線縫穿結扎盲腸遠端，并將7-0絲線雙股打結，留約直徑2 cm線環，以此留兩個7-0線環，用2.5 ml注射器向已結扎盲腸遠端注射生理鹽水1 ml，然后結扎離斷雙側網膜，最后關腹[7-13]；假手術組不同的是找到盲腸后，不做穿孔及結扎，從腹腔取出盲腸后直接將其放回腹腔，然后關腹。

3. 兩組大鼠術后即刻皮下注射生理鹽水，補充手術過程中的體液丟失，劑量5 ml/100 g體重。連接微透析裝置，微透析分別以含有1%濃度的丙二醇的林格氏液溶液為灌流液，以2 μl/min灌注60 min以排除氣泡及沖洗管路。然后分別用1 μg/ml、5 μg/ml、30 μg/ml含1%丙二醇的美羅培南林格氏液做灌流液，以1 μl/min的灌注速度平衡1 h，然后每30 min收集一個樣本，每個濃度收集5個樣本。

4. HPLC-MS/MS法測定透析液中藥物濃度。通過減量法計算美羅培南的在不同大鼠體內的回收率[14]。

結 果

對于所研究的靶部位(肺、血管、皮膚及肌肉)：正常大鼠回收率分別為30.14%±7.62%、26.20%±0.14%、25.90%±1.28%、13.95%±0.32%，膿毒癥大鼠回收率分別為46.43%±1.50%、45.96%±1.78%、33.93%±0.39%、39.48%±2.38%，見圖1、圖2。由此可見，美羅培南在正常大鼠靶部位的回收率均低于膿毒癥大鼠靶部位的回收率，對于正常大鼠及膿毒癥大鼠在研究的靶部位中均是肺部回收率最高。還可以看出，膿毒癥大鼠體內的回收率，肺部與血管回收率基本相等，皮膚與肌肉回收率相差亦在5%左右。

圖1 美羅培南在假手術組大鼠皮膚、肌肉、血管及肺部體內回收率

圖2 美羅培南在膿毒癥大鼠皮膚、肌肉、血管及肺部體內的回收率

討 論

在正常情況下，內皮細胞能夠感受物理或化學信號并做出反應。它通過分泌相關分子，內皮細胞調節著血管收縮，細胞粘附，出凝血功能，平滑肌細胞的增殖及血管壁的炎癥反應。膿毒癥中全身性炎癥反應所產生的氧自由基、血管緊張素Ⅱ以及血流動力學的改變均會不同程度地引發內皮細胞損傷從而誘發微循環功能障礙[15]。微透析取樣技術的原理是利用物質沿濃度梯度擴散和半透膜對小分子化合物具有通透性原理設計的。在微透析取樣過程中,組織中物質(包括藥物)在探針透析膜內外的分布處于一種動態平衡中,但是由于探針持續灌流(不含待測物質)的溶液,導致了藥物在組織液和灌注液之間的擴散不能完全達到平衡,透析液中的藥物含量只是細胞外液中的一部分[16]。出現微循環障礙后使內皮細胞通透性降低，細胞內、外液之間的平衡遭到破壞,根據減量法公式R=(Cin-Cout)/Cin[14]可以計算出膿毒癥大鼠靶部位的回收率高于正常大鼠靶部位的回收率。并且，美羅培南為高蛋白結合率藥物，肺部蛋白含量低，故而美羅培南肺部吸收最少，出現肺部回收率最高的現象。通過微透析技術我們可以研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率，進而推算出不同靶部位的藥物濃度。

1 牛莎, 張睢揚. 膿毒癥和膿毒癥休克抗感染治療進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2013, 6(3): 202-204.

2 Markus Müller 著. 周丁華, 王丹, 童衛杭, 等譯. 微透析技術與藥物研究[M]. 人民軍醫出版社, 2014年版, 第一章微透析技術簡介, 1-3.

3 Ditz C, Bahlmann L, Klaus S, et al. Cerebral metabolism during experimental endotoxin shock and after preconditioning with monophosphoryl lipid A[J]. Clin Neurol Neurosurg, 2014, 126C: 115-122.

4 Nikitas N, Kopterides P, Ilias I, et al. Elevated adipose tissue lactate to pyruvate (L/P) ratio predictspoor outcome in critically ill patients with septic shock: a microdialysis study[J]. Minerva Anestesiol, 2013, 79(11): 1229-1237.

5 王丹, 劉春生, 呂亞麗, 等. 葛根素微透析線性探針相對回收率影響因素的研究[J]. 國際藥學研究雜志, 2011, 38(5): 390-393.

6 劉春生, 劉德鼎, 王丹, 等. 高效液相色譜串聯質譜法研究環磷酰胺線性微透析探針體內外校正影響因素[J]. 國際藥學研究雜志, 2015, 42(3): 362-364.

7 常瑞明, 肖建強, 楊濤, 等. 盲腸不同部位結扎穿孔致膿毒癥模型的研究[J]. 嶺南現代臨床外科, 2012, 12(1): 20-22.

8 趙金峰, 羅進, 劉世賓. 盲腸結扎穿孔致大鼠膿毒癥的模型改良[J]. 浙江中西醫結合雜志, 2008, 18(10): 605-606.

9 郭松喜, 王丹, 劉春生, 等. 膿毒癥實驗動物模型的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2015, 8(5): 635-637.

10 湯耀卿, 李磊. 膿毒癥動物模型制作方略及應用[J]. 中華實驗外科雜志, 2006, 23(12): 1433-1434.

11 Tang CW, Feng WM, Du HM, et al. Delayed administration of D-Ala2-D-leu5-enkephalin, a Delta-opioid receptor agonist, improves survival in a rat model of sepsis[J]. Tohoku J Exp Med, 2011, 224(1): 69-76.

12 Huber-Lang M, Barratt-Due A, Pischke SE, et al. Double blockade of CD14 and complement C5 abolishes the cytokine storm and improves morbidity and survival in polymicrobial sepsis in Mice[J]. J Immunol, 2014, 192(11): 5324-5331.

13 Wu LL, Jia BH, Sun J, et al. Protective effects of ginsenoside Rb1 on septic rats and its mechanism[J]. Biomed Environ Sci, 2014, 27(4): 300-303.

14 Markus Müller 著. 周丁華, 王丹, 童衛杭, 等譯. 微透析技術與藥物研究[M]. 人民軍醫出版社, 2014年版, 第2章微透析技術定量：回收率與校正，8-18.

15 趙光舉, 盧中秋. 膿毒癥內皮細胞損傷與微循環障礙[J]. 臨床急診雜志, 2012, 13(1): 8-13.

16 王丹, 石力夫, 胡晉紅. 微透析技術探針回收率的影響因素研究進展[J]. 國際藥學研究雜志, 2008, 35(4): 261-266.

(本文編輯：王亞南)

郭松喜，王英，劉春生，等. 利用微透析技術研究美羅培南在正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(4)： 420-422.

Recovery of the meropenem micro dialysis probe in normal rats and in rats of sepsis in vivo

GuoSongxi1,2,WangYing2,LiuChunsheng3,ZhouJingchao4,ZhangSuiyang2,WangDan4.

1Departmentofrespiration,MiyunHospital,Beijing101500,China;2Departmentofrespiration;3Departmentoforthopedics;4Departmentofpharmacy,RocketArmyGeneralHospitalofPLA,Beijing100088,China

Correspondingauthor：WangDan,Email:wdyy-618@sina.con

Objective Study the recovery of the meropenem micro dialysis probe in normal rats and in rats of sepsis in vivo. Method Rats randomly divided into two groups: control group(1case)and sepsis group (3 cases). firstly, to probe into the rat skin, muscle, blood vessels and lungs, respectively, then, collect samples, and then, determination of different parts of the recovery. Result The recovery of all research target parts ( lungs, blood vessels, skin and muscles ), the normal rats were 30.14%±7.62%, 26.20%±0.14%, 25.90%±1.28%, 13.95%±0.32%. And the sepsis group were 46.43%±1.50%, 45.96%±1.78%, 33.93%±0.39%, 39.48%±2.38%. The recovery in control group were lower than target parts of the rats of sepsis group, the recovery both in control group and sepsis group at the target of the study area are highest in lung. Conclusion Meropenem was a high protein binding rate of drug, the lung protein content was low, but the pulmonary absorption of meropenem was the least, so meropenem in the lung had the highest recovery rate. By micro dialysis technology research normal and sepsis in rats of different target parts of a recovery, and then calculate different drug concentration of the target area.

Meropenem; Microdialysis; Sepsis rats; Recovery

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.009

國家自然科學基金青年項目(81301662) 北京市科技新星計劃(Z161100004916165)

101500 北京，北京市密云區醫院呼吸科1101500 北京，中國人民解放軍火箭軍總醫院呼吸科2骨科3、藥劑科4

王丹， Email：wdyy-618@sina.com

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2016-03-10)