CXCR4抑制劑AMD3465調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞株增殖、侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

梁濤 王彬 汪濤 柳曦 李捷

·論著·

CXCR4抑制劑AMD3465調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞株增殖、侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

梁濤1，2王彬1汪濤1柳曦1李捷1

目的探討CXCR4抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞株增殖、侵襲的影響。方法培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株A549并分為AMD3465組、對(duì)照組；分別用含有三種不同劑量(50 、100、200 mg/L)AMD3465的DMEM處理以及用不含藥物的DMEM處理。處理后12、24、48 h，檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力和侵襲數(shù)目；處理后48 h，檢測(cè)細(xì)胞中增殖及侵襲基因的mRNA表達(dá)量。結(jié)果處理后12、24、48 h，三種不同劑量(50、100、200 mg/L)AMD3465組細(xì)胞的OD值均顯著低于對(duì)照組、侵襲數(shù)目均顯著少于對(duì)照組，AMD3456劑量較低時(shí)OD值、侵襲數(shù)目與對(duì)照組差距均大于AMD3456劑量較高時(shí)(P<0.05)；處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組；AMD3456劑量較低時(shí)細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組差距均大于AMD3456劑量較高時(shí)(P<0.05)。結(jié)論CXCR4抑制劑AMD3465能夠有效抑制肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲。

支氣管肺癌； CXC受體4； 增殖； 侵襲

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全球每年肺癌所致死亡的人數(shù)超過140萬，肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲是影響肺癌預(yù)后及病情轉(zhuǎn)歸的重要生物學(xué)行為[1-3]。但關(guān)于肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是重要的趨化因子，與多種細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)。近年來關(guān)于肺癌增殖和侵襲的研究認(rèn)為，SDF-1及其受體CXCR4在肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，肺癌組織中CXCL12及CXCR4均呈高表達(dá)的趨勢(shì)[4-5]。但是，目前關(guān)于CXCR4是否直接參與肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控尚未明確。ADM3465是CXCR4的特異性抑制劑，能夠選擇性地抑制CXCR4所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。為了明確CXCR4對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控作用，本研究具體分析了CXCR4抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞株增殖、侵襲的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

A549肺癌細(xì)胞株來自解放軍總醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco公司，RNA抽提試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司，PCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，CXCR4抑制劑AMD3465由解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科合成。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法: A549細(xì)胞株用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至90%后用0.125%的胰蛋白酶常規(guī)消化，消化后的細(xì)胞傳代擴(kuò)增并接種在培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板中的細(xì)胞密度生長(zhǎng)至90%后進(jìn)行處理，對(duì)照組用不含藥物的DMEM處理，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組分別用含有50mg/L AMD3465的DMEM、含有100 mg/L AMD3465的DMEM、含有200 mg/L AMD3465的DMEM處理。

2. 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)方法: 用于細(xì)胞增殖活力的細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液、密度為5×104/ml，處理后12、24、48 h，向培養(yǎng)體系中直接加入MTS試劑盒中的檢測(cè)液，20 μl/孔，繼續(xù)孵育3～4 h后檢測(cè)各培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)。

3. 細(xì)胞侵襲的檢測(cè)方法: 將BD公司的BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber取出并在室溫放置，在上層小室和下層小室內(nèi)加入預(yù)熱到37 ℃的DMEM，使基質(zhì)水化后向上層小室內(nèi)加入消化所得細(xì)胞懸液、每孔加入500 μl細(xì)胞懸液、密度為5×104/ml，下層小室中加入500 μl含有1%胎牛血清的DMEM。不同條件處理12、24、48 h，切下上層小室的微孔膜，5%結(jié)晶紫染色后PBS洗滌2遍，最后在高倍視野下觀察細(xì)胞數(shù)目。

4. 基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)方法: 用于基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)的細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔加入1.5 ml細(xì)胞懸液、密度為5×104/ml，處理后48 h，采用RNA抽提試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒分離細(xì)胞中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算基因的mRNA表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組細(xì)胞的增殖活力比較

處理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細(xì)胞的OD值均顯著低于對(duì)照組；AMD3456劑量較低組OD值與對(duì)照組OD值的差距，大于AMD3456劑量較高組OD值與對(duì)照組OD值的差距(P<0.05)，見表1。

表1 兩組細(xì)胞的增殖活力比較

注:a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

二、兩組細(xì)胞的侵襲能力對(duì)比

處理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細(xì)胞的侵襲數(shù)目均顯著少于對(duì)照組，AMD3456劑量較低組侵襲數(shù)目與對(duì)照組侵襲數(shù)目的差距，大于AMD3456劑量較高組侵襲數(shù)目與對(duì)照組侵襲數(shù)目的差距(P<0.05)，見表2。

表2 兩組細(xì)胞的侵襲能力比較

注：a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

三、兩組細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)差異

處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組；AMD3456劑量較低組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達(dá)量的差距，大于AMD3456劑量較高組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達(dá)量的差距(P<0.05)，見表3。

表3 兩組細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)量比較

注：a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

四、兩組細(xì)胞中侵襲基因的表達(dá)差異

處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細(xì)胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，AMD3456劑量較低組細(xì)胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達(dá)量的差距，大于AMD3456劑量較高組細(xì)胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組細(xì)胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達(dá)量的差距(P<0.05)，見表4。

討 論

SDF-1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的趨化因子，與受體CXCR4結(jié)合后能夠通過激活下游多種信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附等過程。近年來，SDF-1/CXCR4信號(hào)通路與惡性腫瘤的關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注，該信號(hào)通路能夠指示腫瘤細(xì)胞沿著CXCL12的濃度梯度進(jìn)行遷移和運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而向鄰近組織或遠(yuǎn)處組織中SDF-1高表達(dá)的區(qū)域浸潤(rùn)[6-8]。已有研究報(bào)道，肺癌組織中CXCR4和SDF-1呈高表達(dá)的趨勢(shì)[9]，但關(guān)于SDF-1/CXCR4信號(hào)通路對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的影響尚未明確。為了明確SDF-1/CXCR4通路對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，本研究采用CXCR4的抑制劑AMD3465來選擇性抑制CXCR4的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖活力和侵襲數(shù)目進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：不同劑量AMD3465組細(xì)胞處理后12、24、48 h的OD值均顯著低于對(duì)照組、侵襲數(shù)目均顯著少于對(duì)照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲具有抑制作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌增殖和侵襲的調(diào)控。

在肺癌細(xì)胞的增殖過程中，細(xì)胞周期進(jìn)程的加速是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)，而細(xì)胞周期的進(jìn)程又與多種基因的表達(dá)變化密切相關(guān)。CyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白，與CDK4和CDK6結(jié)合所形成的CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物能夠引起Rb蛋白發(fā)生磷酸化并釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期和G2期、促進(jìn)細(xì)胞的增殖[10-11]。PCNA是參與DNA復(fù)制及核酸剪切過程的輔助分子，還能與CyclinD1相互作用并加速細(xì)胞周期的進(jìn)程；Ki-67是細(xì)胞周期進(jìn)程的標(biāo)志分子之一，在細(xì)胞周期的G1期開始逐步出現(xiàn)、在S期和G2期達(dá)到高峰，而在G0期則幾乎不表達(dá)。本研究通過分析CXCR4的抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)量的影響顯示：不同劑量AMD3465組細(xì)胞中處理后48 h CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)量具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌中增殖基因表達(dá)的調(diào)控。

表4 兩組細(xì)胞中侵襲基因的表達(dá)量比較

注：a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

SDF-1/CXCR4通路對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移和運(yùn)動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用， 而肺癌細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不僅依賴于細(xì)胞的黏附、遷移，同時(shí)還與細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解密切相關(guān)。蛋白酶是水解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中多種成分的重要催化酶，能夠促進(jìn)細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的限制并向臨近組織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移。CatB、MMP2、MMP9、MMP13等蛋白酶是與肺癌細(xì)胞侵襲密切相關(guān)的蛋白酶，CatB是細(xì)胞溶酶體的組成部分，能夠有效激活纖溶酶原激活劑并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[12-14]；MMP2、MMP9、MMP13是MMPs家族的重要成員，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等成分具有直接的水解作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解[15-16]。本研究通過分析CXCR4的抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞中上述侵襲基因表達(dá)量的影響顯示：不同劑量AMD3465組細(xì)胞中處理后48 h CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對(duì)肺癌細(xì)胞中侵襲基因的表達(dá)量具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌中侵襲基因表達(dá)的調(diào)控。

綜上所述，SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌增殖、侵襲的調(diào)控；CXCR4抑制劑AMD3465能夠有效抑制肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲。

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(本文編輯：王亞南)

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Experimental study of CXCR4 inhibitor AMD3465 regulating proliferation and invasion of lung carcinoma cell line

LiangTao1,2,WangBin1,WangTao1,LiuXi1,LiJie1.

1DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China;2DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofRocketArmy,PLA,Beijing100853,China

Correspondingauthor：LiJie,Email：13801010576@163.com

Objective To study the effect of CXCR4 inhibitor AMD3465 on proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines. Methods The lung carcinoma cell line A549 was cultured and divided into 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group treated with DMEM containing different dosage of AMD3465 and control group treated DMEM without drug. After 12 h, 24 h and 48 h, the proliferation and invasion number of the cells were detected. After 12 h, the mRNA expression of cell proliferation and invasion genes were detected. Results 12 h, 24 h, 48 h after treatment, OD values of 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group, invasion number were significantly less than the control group，the differences of OD values and invasion number between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05); 48 hours after treatment, mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 of 50mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group; the differences of mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05). Conclusion CXCR4 inhibitor AMD3465 can effectively inhibit the proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines.

Bronchogenic carcinoma; CXC receptor 4; Proliferation; Invasion

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573026)

100853 北京，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院胸外科1100088 北京，中國(guó)人民解放軍火箭軍總醫(yī)院 胸外科2

李捷， Email：13801010576@163.com

R563

A

2017-06-04)