聚醚醚酮/碳納米管/生物活性玻璃復合材料的成骨細胞相容性研究

鄭延延，劉呂花，韓崇濤，熊成東，張麗芳

(1.川北醫學院基礎醫學院，四川 南充 637000； 2.中國科學院成都有機化學研究所，四川 成都 610041)

聚醚醚酮/碳納米管/生物活性玻璃復合材料的成骨細胞相容性研究

鄭延延1，劉呂花1，韓崇濤2，熊成東2，張麗芳2

(1.川北醫學院基礎醫學院，四川 南充 637000； 2.中國科學院成都有機化學研究所，四川 成都 610041)

目的：探討新型聚醚醚酮/碳納米管/生物活性玻璃(PEEK/CNTs/BGs)復合材料的體外成骨細胞相容性。方法：體外培養小鼠成骨細胞MC3T3-E1，通過噻唑藍法、吖啶橙熒光染色法研究PEEK/CNTs/BGs復合材料對成骨細胞增殖的影響。應用掃描電鏡(SEM)觀察MC3T3-E1細胞在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面的黏附生長情況。結果：MC3T3-E1細胞在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面的增殖能力較聚醚醚酮和聚醚醚酮/碳納米管(PEEK/CNTs)復合材料強。SEM實驗結果表明，PEEK/CNTs/BGs復合材料表面有利于MC3T3-E1細胞黏附、鋪展和生長。結論：PEEK/CNTs/BGs復合材料具有良好的成骨細胞相容性，有望作為新型骨科材料。

聚醚醚酮；碳納米管；生物活性玻璃；成骨細胞相容性；骨科材料

傳統骨科金屬材料的彈性模量，如鈦(100 GPa)及鈦合金(105—125 GPa)，比人皮質骨(6—23 GPa)高數倍[1-2]。這種不匹配的彈性模量會引起“應力屏蔽”效應，造成植入體周圍發生骨吸收和骨萎縮，最終植入失敗。此外，金屬材料可能釋放出金屬離子使周圍組織發生炎癥，且在常用的醫學影像技術(CT、MRI等)下金屬材料會產生偽影，不利于骨生長和愈合的有效監控。因此，研發性能更加優良的新型骨科材料是非常必要的。

熱塑性特種工程塑料聚醚醚酮(PEEK)由于其彈性模量和人皮質骨較為接近，具有良好的生物相容性、X射線透過性、CT或MRI成像下無偽影等優點[2-4]，受到材料學和骨科學研究者越來越高的重視，期望其能替代傳統醫用金屬材料用作骨科材料。但PEEK本身是生物惰性材料，植入體內后，不能和骨組織發生牢固的骨整合。生物活性玻璃(BGs)具有良好的生物活性，能和骨組織形成牢固的骨整合，但BGs脆性大、韌性差[5]，將其添加到PEEK中使PEEK獲得生物活性的同時卻降低其優異的力學性能，使之不能滿足用作承力骨的性能要求[2,7]。碳納米管(CNTs)具有優異的力學性能、良好的韌性以及納米特性[6]，PEEK/BGs復合材料中摻雜CNTs可獲得力學性能優異的PEEK/CNTs/BGs復合材料[7]。目前該復合材料的成骨細胞相容性未見文獻報道。本研究將PEEK/CNTs/BGs復合材料與小鼠成骨細胞MC3T3-E1共培養，通過噻唑藍法、吖啶橙熒光染色法研究PEEK/CNTs/BGs復合材料對成骨細胞增殖的影響。應用掃描電鏡(SEM)觀察MC3T3-E1細胞在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面的黏附生長情況。初步評價PEEK/CNTs/BGs復合材料的體外成骨細胞相容性，為該材料下一步體內實驗評價及臨床應用提供科學依據。

1 材料及方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 PEEK/CNTs復合材料(實驗室自制，CNTs的重量分數為6%)；PEEK/CNTs/BGs復合材料(實驗室自制，CNTs和BGs的重量分數分別為6%和4%)；小鼠成骨細胞MC3T3-E1(四川大學華西口腔疾病國家重點實驗室提供)；DMEM培養基(Hyclone公司)；小牛血清(成都奧克生物技術有限公司)；吖啶橙(北京化學試劑有限公司)；噻唑藍(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，MTT，Sigma公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；鏈霉素、青霉素(成都艾科達試劑有限公司)；磷酸鹽緩沖劑(PBS，Hyclone公司)；二甲基亞砜(DMSO)、戊二醛、無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司)。

1.1.2 儀器 熒光顯微鏡(X60，Olympus公司)；掃描電鏡(S-4200，Hitachi公司)；酶標儀(Varioskan Flash 3001，Thermo 公司)。

1.2 細胞培養

采用小鼠成骨細胞MC3T3-E1進行實驗，利用含10%小牛血清及雙抗的DMEM培養基對細胞進行培養，培養液每2 d更換1次。細胞長至約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養以獲得大量細胞供后續實驗。所有的培養均在37 ℃、5% CO2以及飽和濕度的培養箱中進行。

1.3 噻唑藍細胞增殖實驗

噻唑藍(MTT)法是目前檢測細胞增殖較為常用且簡單有效的方法[8-9]。將PEEK、PEEK/CNTs、PEEK/CNTs/BGs復合材料經環氧乙烷滅菌后，置于96孔細胞培養板中，以1×104個/孔的數量接種細胞，每孔加入培養基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培養箱中分別培養1、3和6 d。每個樣品設置3個平行樣，空白對照組為不含樣品的組織培養孔(TCPS)，每2 d更換1次培養基。在相應的時間點棄去原有培養基，用滅菌的PBS緩沖液沖洗2次后，重新加入200 μL新鮮培養基，然后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，放入孵箱培養3.5 h。輕輕吸去上層液體，每孔加入200 μL DMSO，在搖床上震蕩0.5 h，吸取100 μL溶解液轉入新的96孔板中，利用酶標儀測定490 nm處的光學密度值。

1.4 吖啶橙熒光染色實驗

將經環氧乙烷滅菌的PEEK、PEEK/CNTs、PEEK/CNTs/BGs復合材料置于96孔細胞培養板中，以2×104個/孔的數量接種細胞，每孔加入培養基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培養箱中分別培養1、3和6 d。在相應的時間點棄去原有培養基，用滅菌的PBS緩沖液沖洗2次，接著用0.1 mg/mL的吖啶橙溶液避光染色20 min，取出樣品再次用PBS緩沖液沖洗2次，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 掃描電鏡實驗

將經環氧乙烷滅菌的PEEK/CNTs/BGs復合材料置于96孔細胞培養板中，以2×104個/孔的數量接種細胞，每孔加入培養基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培養箱中分別培養1、2和3 d。在相應的時間點棄去原有培養基，滅菌的PBS緩沖液沖洗2次后，用4%戊二醛4 ℃固定2 h，再利用30%、50%、75%、85%、95%、100%的乙醇系列溶液脫水，每次15 min。待樣品干燥后，試樣表面噴金并用SEM觀察材料表面的細胞形態。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 噻唑藍法檢測成骨細胞在材料表面的增殖活性

圖1為小鼠成骨細胞MC3T3-E1在材料表面的MTT增殖檢測結果。由圖可以看出，隨培養時間的增加，各組材料的光學密度值均有一定程度的增加，表明細胞能在材料表面正常增殖生長，材料無毒性。此外，還可以看出，隨培養時間的增加，尤其是培養到第6天，PEEK/CNTs/BGs復合材料的光學密度值明顯高于PEEK和PEEK/6%CNTs復合材料(P<0.05)，說明PEEK材料中引入BGs能有效的提高了其表面的成骨細胞增殖活性。

2.2 吖啶橙熒光染色法檢測成骨細胞在材料表面的增殖活性

圖2、圖3和圖4為細胞在材料表面培養1、3和6d后的吖啶橙熒光染色結果。從圖中可以看出，培養1d后，就有細胞在材料表面黏附，且均勻分布在材料表面；培養 3d后，所有樣品組上的細胞數量均明顯增加，細胞之間的間隙減少，細胞與細胞開始相互連接起來；培養6d后，細胞幾乎長滿了材料表面，細胞間的空隙較少，沒有發現明顯的細胞死亡，說明材料均具有較好的成骨細胞相容性。

對比PEEK和PEEK/CNTs復合材料表面細胞的熒光染色照片(圖2與圖3)，可以看出細胞第1 天便能黏附在兩種材料表面，生長良好并隨著時間的推移能正常生長增殖，表明材料沒有明顯的細胞毒性。但PEEK/CNTs復合材料表面細胞生長情況與PEEK相比，細胞生長密度要小些，可以看出添加碳納米管對細胞生長稍有影響，但尚未表現出明顯的細胞毒性。

對比PEEK/CNTs和PEEK/CNTs/BGs復合材料表面細胞的熒光染色照片(圖3與圖4)發現，PEEK/CNTs/BGs復合材料表面的細胞繁殖較快，生長情況良好，培養3d后就幾乎長滿了材料表面，細胞數量較PEEK/CNTs復合材料上的多些，培養6d后，不僅長滿了材料表面而且開始向上生長形成多層細胞，而PEEK/CNTs復合材料表面細胞間還存在許多間隙，且只形成單層細胞。由此說明添加BGs促進了成骨細胞在材料表面的黏附與生長。

2.3 掃描電鏡觀察成骨細胞在材料表面的黏附生長情況

掃面電鏡觀察成骨細胞MC3T3-E1在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面培養1d和3d后的細胞黏附生長情況，結果如圖5和圖6所示。從圖中可以看出，成骨細胞能較好地黏附在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面且生長形態良好。細胞伸出長短不一的板狀偽足或絲狀偽足緊密貼附在材料表面，附著在材料表面的細胞呈梭形或不規則形，均屬細胞的正常生長形態。隨培養時間的延長細胞密度逐漸增多，細胞間相互接觸，培養3d時，細胞不僅鋪滿PEEK/CNTs/BGs復合材料表面，而且開始三維向上生長。圖5和圖6結果表明PEEK/CNTs/BGs復合材料表面有利于MC3T3-E1細胞黏附、鋪展和生長。

3 討論

PEEK自身的眾多優異性能，如彈性模量更接近骨骼、良好的生物相容性、X射線可透過性等，使其有望替代傳統醫用金屬材料，應用到脊柱、關節等領域。PEEK是一種極具潛力的骨科植入材料，但其自身無生物活性，不能與骨組織形成骨整合，使其應用受到一定程度的限制。BGs的主要成分為45wt%SiO2-24.5wt%CaO-24.5wt%Na2O-6wt%P2O5，植入體內后能通過其表面形成的富二氧化硅凝膠層，誘導類骨磷灰石形成，并通過這層類骨磷灰石與骨組織形成牢固的骨整合[5]。但BGs的脆性大、韌性差、生理環境中疲勞和破壞強度不高等弱點，限制了其在承力部位的應用。將BGs添加到PEEK基體中制備復合材料能改善PEEK的生物活性，但研究發現BGs的引入降低了PEEK的力學性能。而將力學性能較優異的CNTs添加到PEEK/BGs復合材料中制備PEEK/CNTs/BGs復合材料可使PEEK獲得生物活性的同時維持其優異的力學性能。力學性能測試結果表明當CNTs含量為6%，BGs含量為4%時制備的PEEK/CNTs/BGs復合材料力學性能較優異，同時在模擬體液中能誘導類骨磷灰石形成，表明PEEK/CNTs/BGs復合材料在體內可能具有良好的生物活性[7]。

本實驗在此基礎之上，將PEEK/CNTs/BGs復合材料與成骨細胞共同培養，進一步研究該復合材料的體外成骨細胞相容性，為該材料下一步體內實驗評價及臨床應用提供科學依據。MTT能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶的紫色結晶物甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞卻沒有該功能。甲臜能溶在DMSO中，并在490nm波長處有特定的光學密度值，且光學密度值與活細胞數量成正比。隨培養時間推移，PEEK/CNTs/BGs復合材料的光學密度值逐漸增加，且在培養第3天和第6天時均高于PEEK和PEEK/CNTs組，說明PEEK/CNTs/BGs復合材料表面成骨細胞能保持較高的增殖活性。吖啶橙是一種具有高度特異性熒光染料，能透過正常細胞膜使DNA和RNA染色，熒光顯微鏡下使細胞核呈綠色或黃綠色熒光。吖啶橙熒光染色結果同樣說明成骨細胞在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面具有較高的增殖能力。

接種后的細胞在材料表面的生長形態、與材料的黏附情況是研究細胞與材料相互關系的簡單有效的方法，也是評估生物材料細胞相容性的重要指標，細胞在材料上的形態也能較準確地反應出材料對細胞的影響，具有良好生物相容性的材料，不僅細胞增殖正常，無明顯的壞死現象，而且細胞生長形態也正常。黏附是貼壁型細胞增殖生長并發揮其生理功能的重要前提，所以細胞首先必須與材料發生適當的黏附才能進行分化和增殖，進而發揮生理功能[10]。SEM觀察結果發現成骨細胞MC3T3-E1能在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面黏附生長，伸出板狀或絲狀偽足，生長形態正常，且隨著時間的延長，細胞能鋪滿材料表面。SEM結果從細胞生長形態上進一步證明了成骨細胞在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面能正常黏附、鋪展與生長。

通過噻唑藍法、吖啶橙熒光染色法及掃面電鏡觀察，結果顯示成骨細胞能在PEEK/CNTs/BGs復合材料表面黏附、鋪展、生長，且生長形態良好，預示該復合材料具有良好的體外成骨細胞相容性，有望作為新型骨科材料。

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(學術編輯：肖東琴)

本刊網址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Study on osteoblast compatibility of polyetheretherketone/carbon nanotubes/bioactive glasses composite

ZHENG Yan-yan1,LIU Lv-hua1,HAN Chong-tao2,XIONG Cheng-dong2,ZHANG Li-fang2

(1.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000；2.ChengduInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective：To explore osteoblast compatibility of polyetheretherketone/carbon nanotubes/bioactive glasses (PEEK/CNTs/BGs) composite in vitro.Methods：PEEK/CNTs/BGs composite was co-cultured with osteoblast MC3T3-E1invitroto evaluate the effects of the composite on osteoblast proliferation by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide (MTT) and acridine orange fluorescent staining method.Meanwhile,the adhesion and growth of MC3T3-E1 cells on PEEK/CNTs/BGs composite surface were observed by scanning electron microscopy (SEM).Results:It was found that MC3T3-E1 cells on PEEK/CNTs/BGs composite surface had better proliferation activity than that on PEEK and polyetheretherketone/carbon nanotubes (PEEK/CNTs) composite surfaces.SEM results showed that PEEK/CNTs/BGs composite surface was conductive to MC3T3-E1 cells adhesion,spreading and growth.Conclusion:PEEK/CNTs/BGs composite has excellent osteoblast compatibility in vitro and might be used as a novel orthopedic material.

Polyetheretherketone;Carbon nanotubes;Bioactive glasses;Osteoblast compatibility;Orthopedic material

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.04.001

中國科學院“西部之光”重點項目；川北醫學院博士基金項目(CBY16-QD-02)；川北醫學院科研發展計劃項目(CBY16-A-ZD02)

2017-04-12

鄭延延(1986-)，男，博士，講師。E-mail：yanyzheng@163.com

張麗芳，E-mail:zhanglfcioc@163.com

時間：2017-8-15 11∶26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170815.1126.002.html

1005-3697(2017)-04-0484-04

R318.08

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