RegⅣ基因對胰腺癌細胞PANC-1增殖、侵襲、轉移能力的影響

胡啟立，李健，孟紅波,周波,王鋒，宋振順

(1安徽醫科大學上海臨床學院，上海200072；2上海市第十人民醫院)

·論著·

RegⅣ基因對胰腺癌細胞PANC-1增殖、侵襲、轉移能力的影響

胡啟立1,2，李健2，孟紅波2,周波2,王鋒2，宋振順1,2

(1安徽醫科大學上海臨床學院，上海200072；2上海市第十人民醫院)

目的 探討RegⅣ基因對胰腺癌細胞PANC-1增殖、侵襲、轉移能力的影響。方法 取對數生長期的PANC-1細胞，于孵育箱中培養至70%～80%融合，分別以Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體(P-RegⅣ-shRNA組)以及Puro-shRNA慢病毒空載體(P-NC-shRNA組)感染細胞,并設立不感染組(PANC-1組)。48 h后，分別用qRT-PCR法和Western blotting法檢測各組RegⅣ mRNA及蛋白的表達。通過CCK-8試驗檢測細胞增殖情況，利用劃痕試驗和Transwell小室侵襲試驗分別檢測細胞的轉移和侵襲能力。將10只5周齡的雌性裸鼠隨機分成P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組，每組5只。取對數生長期的P-RegⅣ-shRNA和P-NC-shRNA組細胞分別注射入上述兩組中。自接種日起每天觀察腫瘤結節生長情況，6周后處死裸鼠并取出瘤體稱重并測量瘤體體積。結果 P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA和蛋白的表達水平較PANC-1組和P-NC-shRNA組均下降(P均<0.05)。P-RegⅣ-shRNA組細胞增殖活力較P-NC-shRNA組和PANC-1組下降(P均<0.05)。與PANC-1組、P-NC-shRNA組比較，P-RegⅣ-shRNA組48 h細胞遷移距離縮短，穿膜細胞數減少(P均<0.05)。PANC-1組、P-NC-shRNA組各觀察指標比較，P均>0.05。與P-NC-shRNA裸鼠組比較，P-RegⅣ-shRNA裸鼠組腫瘤生長速度慢，腫瘤體積小(P均<0.01)。結論 下調RegⅣ基因可抑制胰腺癌細胞PANC-1增殖、轉移、侵襲。

胰腺腫瘤；RegⅣ基因;再生基因家族；細胞增殖；細胞侵襲

我國胰腺癌的發病率正處于不斷上升態勢[1]，早期轉移是其一個重要特性[2]，也是影響患者生存率的重要原因。再生基因家族(Reg家族)是一組分泌蛋白，在體內發揮促進細胞增殖、抗凋亡的作用[3]。RegⅣ是再生基因家族最近發現的成員，在包括胃癌、結腸癌、胰腺癌等多種消化道惡性腫瘤中特異性表達[4]，過表達RegⅣ與腫瘤細胞的生長、黏附和抗凋亡有關。近期研究表明，RegⅣ基因在胰腺癌的早期發生和進展起著重要作用，提示RegⅣ基因可能是胰腺癌早期診斷和治療的靶基因[5, 6]。為觀察RegⅣ基因對胰腺癌PANC-1細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響，2015年9月～2016年12月，本試驗通過慢病毒下調胰腺癌細胞PANC-1的RegⅣ基因表達[7]，探討其在胰腺癌增殖、侵襲和轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑及儀器 胰腺癌細胞株PANC-1由上海市第十人民醫院肝膽胰外科保存；5周齡體質量約18 g雌性裸鼠購自上海史萊克公司。Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體由上海漢恒生物有限公司構建。DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素(PS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Transwell小室(孔徑為8 μm)購自美國Corning-Costar公司；人工細胞外基質膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養、轉染及轉染克隆的篩選 PANC-1細胞培養于10% FBS、1% PS的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2孵育箱培養，待細胞生長到90%時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的PANC-1細胞，將PANC-1細胞鋪入6孔板中每孔接種1×105個細胞，于孵育箱中培養至70%～80%融合，分別以Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體及Puro-shRNA慢病毒空載體感染細胞，分別命名為P-RegⅣ-shRNA、P-NC-shRNA組，并設立不感染組(PANC-1組)。感染6 h后換用無抗生素的含10% FBS的DMEM培養基培養，48 h后，熒光顯微鏡下觀察，待80%以上細胞帶有綠色熒光后即可進行篩選，將培養基換成含有嘌呤霉素(Puro，2 μg/mL)的選擇培養基，1周后進行單克隆挑選，具體方法為：取100個細胞加入到10 mL完全培養基中沖懸，取96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，顯微鏡下觀察，挑出只有單個細胞的孔并作出標記，2～3 d觀察1次，7 d換液，至細胞長成集落后，采用胰酶消化，然后轉移至24孔板中繼續培養，直至細胞長到需要的數量，期間隔段時間向培養基中加入嘌呤霉素篩選1次。

1.3 PANC-1細胞RegⅣ mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。利用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA。將提取得到的總RNA進行反轉錄獲得cDNA后進行RT-PCR反應。RT-PCR引物：RegⅣ上游引物：5′-CGCTGAGATGAACCCCAAG-3′，下游引物：5′-TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG-3′；β-actin上游引物：5′-CTGGAACGGTGAAGGTGCA-3′，下游引物：5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。反應條件為95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進行40個循環。目的基因表達量采用2-ΔΔCT法計算 。

1.4 PANC-1細胞RegⅣ蛋白表達的檢測 采用Western blotting法。使用蛋白裂解液裂解各組細胞獲得蛋白，并使用BCA法測定其蛋白濃度。使用蛋白上樣緩沖液及裂解液將各組蛋白樣品稀釋成等體積等濃度，每孔加入蛋白樣品20 μg，進行聚丙酰胺凝膠電泳、轉膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，使用PBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加ECL發光劑反應2 min，X線光片上曝光1 min，膠片洗滌干燥，用FluorChemQ多功能成像和定量分析系統將膠片成像。結果重復3次得到穩定結果。用 Image J 圖像軟件進行灰度分析，以空白對照組灰度值為參考，對目的蛋白相對表達量進行標準化。

1.5 PANC-1細胞增殖活力測定 采用CCK-8法。取對數生長期細胞，消化成單細胞懸液，稀釋成1×104/mL,接種于96孔板中，每孔加細胞懸液100 μL，分別于24、48、72 h后換液，加入培養液100 μL，再每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1 h后酶標儀450 nm處測光密度(A),并減去空白處A得到實際A值，每組做3個復孔取平均值。增殖活力=(實驗組A值-空白對照A值)/(初始A值-空白對照A值)。

1.6 PANC-1細胞轉移能力檢測 采用細胞劃痕試驗。在6孔板中分別加入各組細胞，每孔鋪入5×105個細胞，每孔加完全培養液2 mL,并放入5% CO2、37 ℃孵育箱中培養，待細胞長至完全融合后，使用無菌的200 μL移液器tip頭在培養板底部呈“+”劃痕，用無血清培養基洗滌3次，去除劃下來的細胞團并加入不含血清的純DMEM培養基，倒置顯微鏡下拍照，記錄初始間距，置入孵育箱中繼續培養，48 h后再次在相同的位置拍照，每組取5個點進行測量，取平均值作為遷移的相對間距，并與初始間距進行比較。

1.7 PANC-1細胞侵襲能力檢測 采用細胞侵襲試驗。將各組細胞分別鋪到6孔板中，待細胞長至70%～80%融合時，胰蛋白酶消化后用不含血清的純DMEM培養基沖懸至1×105/mL。用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃環境下30 min使Matrigel聚合成凝膠，小室使用前用純培養基水化1 h。將上述準備的細胞懸液加到Transwell小室的上室，每孔加細胞懸液200 μL，注意使細胞均勻分布在上室內，下室內加入含有10% FBS的DMEM培養基800 μL，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養48 h后取出，用棉簽頭去除Matrigel基質膠和未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色3 min，用刀片將膜切下，貼到載玻片上，顯微鏡下進行拍照并觀察，隨機取5個視野的細胞進行計數并計算平均值。

1.8 裸鼠成瘤試驗 取對數生長期的P-RegⅣ-shRNA和P-NC-shRNA組細胞，使用胰蛋白酶消化離心稀釋到細胞密度為1×107/mL。將10只5周齡的雌性裸鼠隨機分成P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組，每組5只，1%戊巴比妥鈉0.1 mL腹腔注射麻醉。每組分別接種1種細胞，每只裸鼠下注射細胞懸液0.1 mL。接種細胞后放置于恒溫( 26±2)℃、濕度 45%～50%、無菌凈化屏障系統內飼養，自接種日起每天觀察腫瘤結節生長情況，6周后處死裸鼠并取出瘤體稱重,測量瘤體體積。腫瘤體積按V=長×寬2×0.5公式計算。

2 結果

2.1 各組RegⅣ mRNA及蛋白表達比較 PANC-1組、P-NC-shRNA組、P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA的相對表達量分別為1.02±0.07、1.06±0.07、0.22±0.03；RegⅣ蛋白的相對表達量分別為2.57±0.10、2.53±0.12、0.50±0.06。P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA和蛋白相對表達量較PANC-1組和P-NC-shRNA組均下降(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.2 各組不同時間細胞增殖活力比較 PANC-1組24、48、72 h后細胞增殖活力分別為0.60±0.07、1.25±0.06、2.63±0.09，P-NC-shRNA組分別為0.58±0.07、1.17±0.04、2.43±0.05，P-RegⅣ-shRNA組分別為0.41±0.05、0.75±0.06、1.49±0.05。P-RegⅣ-shRNA組細胞增殖活力較P-NC-shRNA組和PANC-1組下降(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.3 各組細胞轉移和侵襲能力比較 PANC-1組、P-NC-shRNA組、P-RegⅣ-shRNA組 48 h 遷移距離分別為(0.37±0.14)、(0.31±0.18)、( 0.03±0.02)mm,穿膜細胞數分別為(32.2±1.7)、(28.0±3.5)、(18.7±5.1)個/HP。與PANC-1組、P-NC-shRNA組比較，P-RegⅣ-shRNA組各指標均降低(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.4 RegⅣ對裸鼠體內胰腺癌PANC-1細胞生長的影響 裸鼠皮下接種1×106個細胞后100%可以長出腫瘤，P-NC-shRNA裸鼠組、P-RegⅣ-shRNA裸鼠組接種細胞后長出肉眼可見腫瘤的時間分別為(5.2±0.8)d、(8.6±0.9)d，中間無一例死亡。P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組的腫瘤體積分別為(1.304±0.148)、(2.645±0.583)cm3。P-RegⅣ-shRNA裸鼠組腫瘤生長速度慢于P-NC-shRNA組，腫瘤體積小于P-NC-shRNA組(P均<0.01)。

3 討論

腫瘤的發生發展是多種因素共同作用的結果[8]，胰腺癌的早期轉移是影響胰腺癌患者預后的重要原因。90%胰腺癌患者確診時已處于疾病的中晚期[9]，因此針對胰腺癌侵襲轉移機制的研究對于提高胰腺癌診斷價值和治療效果非常重要。

RegⅣ基因在消化道惡性腫瘤中的發病及發展中，特別是在促進腫瘤細胞增殖、抗凋亡中發揮重要作用。研究表明，其在包括胰腺癌的多種腫瘤組織中表達增加[3, 4, 10]。Hedgehog信號通路是生物體內的一條重要的信號傳導通路。Hedgehog信號通路在包括胰腺癌的多種腫瘤中異常激活，在胰腺癌細胞株和組織中Hedgehog信號通路均被異常激活[11～14]。GLI1是Hedgehog信號通路中轉錄因子。我們的前期研究發現，RegⅣ是GLI1的下游靶基因[15]。本試驗通過體內及體外試驗來探討RegⅣ基因對胰腺細胞增殖、轉移和侵襲能力的影響。本研究中，我們通過將帶有shRNA-RegⅣ干擾序列的慢病毒轉染到胰腺癌細胞PANC-1中，從mRNA和蛋白水平證實RegⅣ表達下調。細胞增殖試驗提示，下調RegⅣ基因的細胞生長速度較轉染空病毒的細胞明顯減慢。進而我們進行了裸鼠皮下成瘤試驗，在給裸鼠皮下分別接種P-RegⅣ-shRNA細胞和P-NC-shRNA細胞相同的時間后，P-RegⅣ-shRNA裸鼠組的腫瘤體積較P-NC-shRNA裸鼠組減小。體內和體外試驗表明，下調RegⅣ基因可以抑制胰腺癌細胞增殖。

我們還通過細胞劃痕試驗和Transwell侵襲試驗來探討下調RegⅣ基因后PANC-1細胞的轉移和侵襲能力變化。在劃痕試驗及Transwell侵襲試驗中，我們利用不含血清的純DMEM培養基培養細胞，細胞缺乏增殖所需的必需生長因子及營養物質，增殖受到抑制，消除增殖對試驗結果的影響。結果顯示，下調RegⅣ基因后PANC-1細胞的轉移和侵襲能力均較P-NC-shRNA組下降，表明RegⅣ基因可以加強胰腺癌細胞的轉移和侵襲能力，該結果與RegⅣ基因在其他癌癥中的研究[4, 10, 16]結果一致。Wang等[16]發現，RegⅣ通過GPR37促進胃癌的腹膜轉移。Bishnupuri等[17]研究發現，RegⅣ基因在結直腸癌中可以促進有絲分裂。Zhu等[18]研究發現，在結直腸癌中RegⅣ與MMP-7相互作用共同影響患者預后。但RegⅣ基因在胰腺癌中如何發揮作用的機制還不清楚，具體研究還有待進一步開展。

綜上所述，本研究結果表明RegⅣ基因在胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移中發揮促進作用，其有可能是胰腺癌潛在的治療靶點。

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Effects of RegIV on proliferation, invasion, and migration of pancreatic cancer cells PANC-1

HUQil1,LIJian,MENGHongbo,ZHOUBo,WANGFeng,SONGZhenshun

(1ShanghaiClinicalFacultyofAnhuiMedicalUniversity,Shanghai200072,China)

Objective To explore the effects of RegIV gene on the proliferation, invasion, and migration of pancreatic cancer cells PANC-1. Methods PANC-1 cells in logarithmic growth phase were cultured in the incubator until they reached 70%-80% confluence. PANC-1 cells were transfected with Puro-P-RegIV-shRNA lentiviral vector (P-RegⅣ-shRNA group) and Puro-shRNA lentiviral empty vector (P-NC-shRNA group), respectively. Cells without transfection or with null-transfection were served as controls (PANC-1 group). At 48 h after transfection, quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting were used to detect the expression of RegIV mRNA and protein. The CCK-8 test was used to detect the proliferation. Scratch test and Transwell chamber test were used to detect the migration and invasion of the cells, respectively. Ten 5-week-old female nude mice were randomly divided into the P-RegⅣ-shRNA nude mouse group and P-NC-shRNA nude mouse group with 5 in each group, which were then injected with P-RegⅣ-shRNA and P-NC-shRNA cells in logarithmic growth phase in the above two groups. The growth of tumor nodules was observed every day from the day of inoculation. After 6 weeks, the nude mice were sacrificed and the tumor volume was measured. Results The expression levels of RegIV mRNA and protein in the P-RegⅣ-shRNA group were significantly lower than those of the PANC-1 group and P-NC-shRNA group (bothP<0.05). Cells in the P-RegⅣ-shRNA group had a lower proliferative capacity than cells in the P-NC-shRNA group and PANC-1 group (P<0.05). Moreover, compared with the PANC-1 group and P-NC-shRNA group, Puro-P-RegIV-shRNA group showed shorter transmembrane distance and decreased number of transmembrane cells, indicating decreased migration ability (allP<0.05). No significant differences were found in the above parameters between the PANC-1 group and P-NC-shRNA group (allP>0.05). Besides, tumor growth rate and the tumor volume in nude mice were decreased significantly in the P-RegⅣ-shRNA nude mouse group as compared with those of the P-NC-shRNA nude mouse group (P<0.01).Conclusion Down-regulation of RegIV could inhibit the proliferation, invasion, and migration of PANC-1 cells.

pancreatic neoplasms; RegIV gene; regenerating gene family; cell proliferation; cell invasion

國家自然科學基金資助項目(81670582)。

胡啟立(1991-)，男，在讀碩士，主要研究方向為胰腺癌的基礎研究。E-mail:1061167453@qq.com

宋振順(1961-)，男，教授，主要研究方向為干細胞移植。E-mail:zhenshunsong@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.001

R737.9

A

1002-266X(2017)29-0001-04

2017-04-07)