電刺激影響牛肉成熟過程中嫩度的信號通路分析

沈瑾

摘要 牛肉品質的好壞，最重要的指標是嫩度。介紹了牛肉成熟機制研究進展，包括在牛肉成熟過程中嫩度的影響因素和加快牛肉成熟的技術，討論了電刺激影響嫩度的分子機理，主要通過糖酵解代謝途徑、鈣激活中性蛋白酶途徑、溶酶體途徑、氧化應激途徑影響嫩度。電刺激影響牛肉成熟過程中嫩度的信號通路表明，牛肉的嫩度與氧化和凋亡有密不可分的聯系。

關鍵詞 牛肉成熟；嫩度；電刺激；信號通路

中圖分類號 S879.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0083-04

The Signal Pathway Analysis of Tenderness as a Result of Electrical Stimulation in the Process of Beef Maturation

SHEN Jin （Xintai Agricultural Bureau，Xintai，Shandong 271200）

Abstract Tenderness is an important indicator for evaluation of beef quality.This paper introduces research progress of beef mature mechanism，including the factors affecting meat tenderness and technology accelerating meat mature，discusses the molecular mechanism of tenderness as a result of ES.Meat tenderness is affected mainly by glycolytic metabolic pathway，calpains pathway，lysosomal pathway，oxidative stress pathway as a result of electrical stimulation.The pathways indicate that meat tenderness is closely related to oxidation and apoptosis.

Key words Beef maturation；Tenderness；Electrical stimulation；Signal pathway

肉類產業的發展經歷了3個過程。第1個過程主要是為了滿足消費者的需求而進行的肉類生產，利用增大畜禽養殖數量的方法來增加肉類的供應量；第2個過程是利用先進的管理技術加快畜禽生長，提高產肉率；第3個過程是聚焦肉類品質的改善，來滿足消費者日益增長的肉制品需求。當前，肉類產業正處于第3個過程的初期，科學家們也越來越重視肉類品質改善以及食用安全的研究。

牛肉品質的好壞，最重要的指標是嫩度[1]。大量的試驗調查證實，嫩度的優劣可以被消費者分辨出來，而且他們很愿意購買優質牛肉[2]。嫩度直接決定著牛肉食用品質的優劣[3]。美國肉牛協會（NCBA）將研究牛肉嫩度的改善方法和提高嫩度的一致性作為提高牛肉市場份額的重要任務[4-5]。所以，我國牛肉要提高在世界牛肉市場的份額，改變依賴進口優質牛肉的被動局面，必須將改善牛肉嫩度作為核心任務。

1 牛肉成熟機制研究進展

剛屠宰后的熱鮮肉具有可接受的嫩度，尸僵期嫩度最差[6]，隨著成熟時間的延長嫩度逐漸得到改善[7]，而不同動物品種和個體間成熟的速度和進程并不相同，從而造成肉的最終嫩度極不均一[8]。

1.1 成熟過程中影響肉嫩度的因素

研究表明，結締組織構成及含量、肌節長度[9]、肌內脂肪含量、骨架蛋白降解程度[10]等方面是成熟過程中影響肉嫩度的主要因素。其中，骨架蛋白是一個關鍵因素。

肌纖維是構成肌肉的基本結構，是決定肌肉嫩度的關鍵因素。肌原纖維在I帶和Z盤結合處（靠近Z盤的I帶上）的斷裂，直接與肉的嫩化有關。肌原纖維由多種蛋白構成，骨架蛋白的降解能提高肉的嫩度，前期研究已證實肌聯蛋白（Titin）、伴肌動蛋白（Nebulin）、肌鈣蛋白T（Troponin-T）、肌間線蛋白（Desmin）等蛋白與嫩度密切相關[11]。

Titin廣泛存在于動物的骨骼肌和心肌中，位置位于Z線及M線間，其N未端與Z盤結合，多肽鏈從I帶一直延伸到A帶，在I帶與粗絲結合伸縮性較強，而在A帶伸縮性較弱，因此Titin被稱為彈性微絲，具有調節粗絲長度，穩定粗絲，保持肌節完整性的作用。Nebulin的C末端與Z盤結合，使細絲和Z盤牢固連接，從而穩定細絲的空間穩定性[12]。Desmin為中間絲蛋白[13]，環繞肌原纖維Z線，從而連接相鄰肌原纖維[14]。牛宰后儲存過程中Desmin被降解[15-16]，整個骨骼肌細胞有序性及完整性[17]被破壞，牛肉嫩度提高[18]。Troponin-T是鈣蛋白酶（μ-calpain）的底物，Troponin-T的降解可能是宰后蛋白水解的指標。牛肉中純化得到的Troponin-T能被μ-calpain降解，產生30 kD的多肽[19]。此外，用蛋白質印跡法免疫印跡試驗（western blot）證明，在成熟牛肉中發現的30 kD的多肽是Troponin-T的產物，且宰后時間與2條主要條帶30 kD和28 kD的出現密切相關[20]。Troponin-T是介導肌動蛋白-肌球蛋白相互作用的復合物的一部分。宰后肌鈣蛋白T的降解，以及在 Ⅰ 帶與其他蛋白相互作用的減弱，可能導致中肌原纖維在 Ⅰ 帶區域出現斷裂，產生肌原纖維的小片化。然而，由于肌鈣蛋白T是骨骼肌的基本部分，它在宰后嫩化過程中的作用還有待于進一步研究[21]。

1.2 加快肉品成熟的技術

肉的嫩度主要取決于肌動蛋白（Actin）和肌球蛋白（Myosin）的結合狀況、肌纖維中骨架蛋白的完整程度及結締組織的構成、性質及含量，所有用來提高肉嫩度的方法都與這些蛋白質的變化有關。

1.2.1 基因調控及重組嫩化。目前已經完成了編碼鈣激活酶（Calpain）和鈣激活酶抑制蛋白（Calpaststin）的基因克隆和染色體定位，利用反義技術等基因調控手段，可以增加處在生長發育階段鈣激活酶抑制蛋白的含量，降低鈣激活酶的活性，降低肌肉中蛋白質代謝速度，提高瘦肉產量。在動物屠宰前使用調控手段提高肌肉中鈣激活酶的含量或降低鈣激活酶抑制蛋白含量的方法促進肉的嫩化。

1.2.2 電刺激嫩化。

肉牛屠宰放血后，施以電刺激處理，可以快速降低肉的pH，影響肉的pH/溫度窗口和Calpains酶系的活性，從而達到肉快速嫩化的目的[22-23]。

電刺激是指使用特定電壓、時間和頻率，對屠宰后的胴體進行的操作[24]。電刺激的電流經過神經系統（宰后4～6 min）或者直接使肌膜去極化，從而引起肌肉收縮[25]。在此過程中，糖酵解速率提高約100倍[26]，pH加速降低，肉在較高溫度下進入尸僵狀態，避免了冷收縮的發生[27]。

電刺激的參數對作用效果有很大的影響，這些參數包括電壓、電流、波形、頻率、實施時間、電極類型、電極的位置等。

1749年，Benjamin Franklin首次對宰后火雞進行電刺激，然而直到1951年，美國人Harsham&Deatherage（美國專利號2，544，681）和Renschler（美國專利號2，544，724）才首次申請專利[28]。新西蘭工業首先應用電刺激改善羊肉品質，隨后，在世界范圍內的肉類屠宰加工業都進行了一項技術革新，即利用電刺激技術來改善肉類品質[29]。電刺激最早用來避免肉類冷收縮導致的韌化作用[30]，后來，電刺激作為肉類快速成熟技術，用來縮短肉類成熟時間，加速肉類嫩化過程[31]。并且，電刺激還可以改善肉色，避免產生熱環。

1.2.3 超高壓嫩化。

對尸僵前的肌肉加壓可提高肉的嫩度。很多學者均報道了100～300 MPa的壓力對肉進行高壓處理有助于肉嫩度的提高[32]，但關于高壓對肉嫩化的作用機理還有待完善[33]。試驗發現，高壓可以瞬間提高肌漿中鈣離子的濃度，從而激活鈣激活酶，降解肌纖維中的結構蛋白，導致肌原纖維完整性破壞，提高肉的嫩度。

1.2.4 注射氯化鈣。Calpain的激活需要充足的鈣離子，但是宰后肌肉內的鈣離子濃度太低，因此，加入外源鈣離子可以使Calpain充分激活，從而使肉產生最大嫩化效應。最常使用的是動脈或者肌肉注射氯化鈣溶液技術來提高鈣離子濃度，改善肉品質。

1.2.5 超聲波處理。

超聲波最早在改善肉品嫩度中的應用是美國農業調查所的Morse Solomon和John Long在1992年利用小塊的高能炸藥在水中爆炸所產生的超聲波處理肉，破壞了肉內蛋白及聯接鍵，降低了肉品硬度，從而達到嫩化作用。試驗證實，超聲波可以較好地改善肉的嫩度。

2 電刺激影響嫩度的分子機理

2.1 通過糖酵解代謝途徑影響嫩度

動物屠宰后，肌肉中的能量代謝系統從開始的有氧代謝轉為無氧代謝，ATP主要來源于糖原降解為乳酸及磷酸肌酸中磷酸轉移給ADP [34]。肌酸激酶能夠催化ATP與ADP間磷酸基團的可逆轉移。前期研究中，確定了20多種肉質標記蛋白，主要有骨架蛋白質比如肌聯蛋白（Titin）、伴肌動蛋白（Nebulin）、肌鈣蛋白（Troponin-T）；代謝酶比如肌酸激酶（Creatine Kinase）、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase）、糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase）等。在屠宰后24 h的可溶性蛋白質組分中發現了肌酸激酶[35]，豬宰后總蛋白[36]及牛肉可溶性蛋白質中[37]肌酸激酶片段的豐度增加。目前，代謝酶作為肉品質標記的研究還不多，但根據前期已有蛋白質組數據表明，代謝酶將會成為很好的肉類標記蛋白。

研究認為，電刺激能夠加速宰后的糖酵解[38]，而且發現有些代謝酶例如肌酸激酶和磷酸丙糖異構酶因為電刺激而導致表達改變[39]。電刺激處理使牛肉中蛋白水解酶的活性增加，也使許多關鍵的代謝酶水解，且這種水解和嫩化有關系[40]。并且，電刺激對嫩度的影響是通過pH與溫度的相互作用來完成的。改變胴體的溫度要比改變pH難，因此，在實際應用中，可以考慮在最佳的pH和溫度下進行電刺激來提高牛肉的嫩度。電刺激加速胴體內糖酵解途徑，防止肌肉快速冷卻時的冷收縮，使胴體內能量大量消耗，ATP轉化ADP為磷酸鹽，釋放出鈣離子，乳酸積累，形成高溫低pH環境，嫩度提高。

2.2 通過鈣蛋白酶途徑影響嫩度 物理性破壞提高牛肉嫩度的機理，可能是破壞牛肉本身提高成熟的能力，或者是物理破壞引起的某種方式，又或者是引起肌漿網中過量鈣離子的釋放，從而引起攣縮帶的出現，導致肌原纖維的超微結構改變[41]。而攣縮帶肌節的斷裂有可能是因為物理破壞，也有可能是因為肌原纖維超微結構的降解，使蛋白酶更多地暴露，加快了蛋白質的降解[42]。

前期研究表明，細胞骨架蛋白Titin、Nebulin、Desmin和Troponin-T的降解使肌原纖維發生一系列的物理、化學和結構的變化，導致肌纖維小片化，破壞了肌纖維結構的完整性，并最終改善了肉嫩度[43]。電刺激后骨架蛋白：肌間線蛋白（Desmin）、肌鈣蛋白-T （Troponin T α-異構體）、肌球蛋白結合蛋白H（Myosin binding protein H）表達下調。電刺激的電流經過神經系統或者直接使肌膜去極化，從而引起肌肉收縮，溫度升高，pH加速降低，可能是由于改變了Calpain/Calpastatin的比例[44]，或者是由于提高肌肉鈣離子濃度激活了Calpains蛋白酶體系，從而導致蛋白質的降解加速，肉嫩度提高。

2.3 通過溶酶體途徑影響嫩度 溶酶體位于肌細胞的肌漿中，在哺乳動物的細胞降解機制中起重要作用。溶酶體水解酶大多數是可溶性的，主要包括糖苷酶、核酸酶、磷酸酯酶、蛋白酶、脂肪酶等，少數整合在膜上，將生物大分子水解為可吸收利用的小分子。如果酸性水解酶從溶酶體釋放出來，就會破壞哺乳動物的細胞結構要素。

過氧化物氧化還原酶Prx6是溶酶體中一類重要的水解酶，Prx6是一個雙功能蛋白，同時具有過氧化物氧化還原酶和溶酶體組織蛋白酶的活性[45-46]。Prx6在細胞內調控機體生長和代謝過程、肌原纖維斷裂過程、宰后肌肉嫩化過程。溶酶體內的酶都是酸性水解酶，反應的最適pH約為5.0，溶酶體的膜上有質子泵，將H+泵入溶酶體，使pH降低。當細胞pH下降到5.0，酸性水解酶被激活，使溶酶體膜水解裂開，釋放出溶酶體酶，導致細胞自溶。當細胞中pH接近中性時，Prx6在肌漿中發揮過氧化物氧化還原酶活性，當細胞中pH為5.0左右時，Prx6在溶酶體中發揮鈣離子依賴的磷脂酶A2 活性，利用溶酶體途徑來調控肉類中骨架蛋白的降解[47]。電刺激后pH不斷下降，直到pH為5.4左右，鈣離子濃度升高，Prx6主要發揮鈣離子依賴的磷脂酶 A2 活性，溶酶體水解酶從破裂的溶酶體膜中釋放出來，水解肌肉蛋白，改善嫩度。

另外，電刺激通過溶酶體途徑影響嫩度也有可能是由于凋亡酶的作用。因為在細胞凋亡中，溶酶體可以消化內吞的凋亡小體，釋放大量溶酶體水解酶進行壞死和自噬性細胞死亡。然而更多研究表明，溶酶體不僅可以消化內吞的凋亡小體，它所釋放出的水解酶也可以引起溶酶體信號途徑的凋亡，并且，電離輻射、細胞因子缺失、熱等外界因素可引起內源性途徑，提高線粒體膜的通透性，釋放細胞色素C等凋亡相關蛋白，激活凋亡酶誘導細胞凋亡。

2.4 通過氧化應激途徑影響嫩度 氧化應激，指的是生物體受到外界傷害性刺激后產生活性氧積累，產生細胞毒性，致使生物體內組織損傷的過程。生物體免疫應答需要適量活性氧，但如果活性氧水平超出抗氧化能力，就會產生氧化應答，利用抗氧化作用維持體內氧化還原平衡，引發生物膜脂質過氧化、細胞內蛋白質和酶變性、DNA損傷，從而引起細胞死亡、凋亡和組織損傷，導致疾病的發生[48]。

動物受到外界刺激后，可以引發很多條不同的信號傳導途徑，而且這些途徑相互作用，叫做交叉作用。活性氧ROS作為一類第二信使，傳遞應激信號，對細胞產生各種作用。適度的ROS水平可以有效激活細胞的氧化還原敏感型信號通路如MAPK、PI3K/Akt等[49-50]，各通路之間可以相互聯系，MAPK、PI3K/Akt通過磷酸化來調節hsf-1、p53、nf-κb[51]等轉錄因子，從而誘導一系列氧化還原敏感型基因的表達，控制細胞對生長、凋亡、應激等信號的反應。

生物體的信號傳遞指的是，細胞在感知到胞外刺激以后，利用細胞內信號分子的逐級傳遞，誘導產生一系列細胞質和細胞核事件和生理生化反應的過程。其中，MAPK級聯途徑在真核生物細胞內的信號傳遞中具有不可忽視的作用[52]。MAPK成員分為MAPK、MAPKK和MAPKKK，在信號傳遞時氨基酸殘基磷酸化逐級被激活。MAPK激活后可能在細胞質中激活別的蛋白酶，也可能使細胞骨架磷酸化，也可能在細胞核中利用磷酸化的轉錄因子調控基因表達。動物細胞中的MAPK信號傳導途徑至少存在4條，而且激酶的激活都要在保守的位點進行雙重磷酸化[53-55]。胞外信號分子作用于至少3種類型受體：酪氨酸蛋白激酶型、組氨酸蛋白激酶型、有7段的跨膜區域的蛋白受體[56]。在動物中，生長因子、激素等分別在相應酪氨酸激酶型受體及7段的跨膜區域的蛋白受體上作用，引發了ERK1/ERK2途徑[57]。其中，受到Ras激活ERK1/ERK2途徑很受關注。目前，國內外對于在肉類成熟的氧化應激途徑中酶類的研究還很少。

過氧化物氧化還原酶Prx是近年來發現的可以保護機體細胞免受氧化劑損傷的蛋白質家族，可以清除機體內的H2O2和烷基過氧化物，通過它的過氧化物酶活性，使細胞避免氧化損傷。除了抗氧化活性外，還參與多種生物學功能，比如細胞增殖、分化、凋亡[58]、基因表達和細胞內信號轉導等。其中，Prx6位于胞漿，在肺中的含量最高，具有過氧化物酶活性和磷脂酶A2活性。前期研究證明，Prx6具有過氧化物氧化還原酶活性，活性氧（ROS）誘導氧化應激，激活Prx6[59-62]，降解活性氧[63]。Yang等[64]用雙向電泳技術分析大白豬和梅山豬背最長肌的差異表達蛋白，鑒定出Prx6在2個品種間表達存在著顯著差異，在隨后的研究工作中，把Prx6基因當做豬肉品質性狀的候選基因，探索了Prx6基因的多態性與豬肉品質性狀之間的關系。Prx6在pH接近中性時，發揮過氧化物氧化還原酶活性，通過p38 MAPK級聯途徑刺激增殖和抑制細胞凋亡。電刺激后pH不斷下降，直到極限pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，Prx6主要發揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性，通過溶酶體途徑使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38 MAPK級聯途徑，抑制增殖，促進氧化凋亡，嫩度提高。

另外，哺乳動物中，磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP蛋白有雙重作用，包括脂質結合及使絲氨酸蛋白酶受到抑制[65]。PEBP4是PEBP家族的一員，不僅抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2-MAPK途徑[66-67]，而且抑制能夠活化AKT的JNK途徑，ATK能夠推動細胞侵襲和轉移[68-70]。Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibit or protein，RKIP），屬于PEBP家族，酵母雙雜交的試驗證明，RKIP和PEBP4可以抑制Raf-1激酶活性，在MAPK級聯信號傳導途徑中使Raf-1及MEK1失活[71-72]。PEBP與Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK級聯信號傳導。牛屠宰后胴體內產生活性氧，激活MAPK級聯途徑，PEBP與Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信號傳導途徑。電刺激加速PEBP抑制MAPK級聯途徑，抑制增殖，加速氧化凋亡，提高嫩度。

氧化應激能夠激活PI3K/Akt信號通路。PI3K（phosphoinositide 3-kinase）具有Ser/Thr激酶和磷脂酰肌醇激酶活性[73]。Akt又稱PKB（protein kinase B），也是一種Ser/Thr激酶。近年的研究表明，細胞可被內外因素誘導啟動PI3K/Akt傳導途徑，促進細胞增殖、分化、轉移，抑制細胞凋亡[74-75]。研究表明， PI3K和JAK2也參與Prx6的激活[76]。

3 展望

電刺激通過糖酵解代謝途徑、鈣激活中性蛋白酶途徑、溶酶體途徑、氧化應激途徑影響嫩度的信號通路表明，牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯系；電刺激抑制氧化應激，抑制增殖，加速氧化凋亡，加快嫩化。具體的機制還需要進一步的試驗驗證，比如對牛肉中基因進行分離及遺傳效應分析，基因的敲除或者過表達、加抑制劑，啟動子克隆和轉錄因子的研究，可以進行基因結構、時空表達譜、多態性及性狀關聯分析等方面的研究，建立其與嫩度的關系，從而指導生產。從基因水平上，進一步研究代謝通路及基因網絡， 具有非常重要的理論意義。

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