液相色譜—同位素質譜法鑒定蜂蜜摻假

陳亞威 張業鵬 范志勇

摘要 [目的]探討液相色譜-同位素質譜法（LC-IRMS）技術在蜂蜜摻假鑒定中的應用效果。[方法]采用LC-IRMS法檢測隨機抽樣的62個蜂蜜樣品，對蜂蜜中果糖（Fru）、葡萄糖（Glu）、二糖和三糖δ13C值進行測定。[結果]由于真實蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值與最小值的差值小于2.1‰，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）為-1‰ ～1‰，且不得含有寡糖，所以該次檢測樣品中有48.38%的蜂蜜不合格，摻假摻雜以添加C-3 植物源轉化產物和淀粉糖漿為主，應加強對這類摻假的監控管理。[結論] LC-IRMS實現了蜂蜜中各種糖組分如果糖、葡萄糖、二糖和三糖等δ13C的分離與分析，可進行添加了C-3糖漿的摻假鑒定，大大提高了蜂蜜摻假的檢測能力。

關鍵詞 液相色譜-同位素質譜；蜂蜜；摻假；δ13C值

中圖分類號 S896.1；TS207.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0009-02

Identification of Honey Adulteration by Liquid Chromatography-isotope Mass Spectrometry （LC-IRMS）

CHEN Ya-wei1，2， ZHANG Ye-peng1，2， FAN Zhi-yong2，3

（1.School of Mechanical Engineering， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068；2.Key Lab of Modern Manufacture Quality Engineering， Wuhan， Hubei 430068；3.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The aim was to explore application of LC-IRMS technique in identification of honey adulteration. [Method] We detected 62 honey samples by LC-IRMS， and determined δ13C value of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey. [Result] The difference of maximum and minimum δ13C of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of true honey was less than 2.1‰， and δ13CFru - δ13CGlu was from -1‰ to 1‰， and there was no oligosaccharides， so 48.38% of samples was no qualified. The adulteration was mainly C-3 plant products and starch syrup， so the monitoring management of adulteration should be strengthened. [Conclusion] LC-IRMS realizes the δ13C isolation and analysis of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey， so it can be used in the adulteration identification of C-3 syrup and can improve the detection capability of honey adulteration.

Key words Liquid chromatography-isotope mass spectrometry （LC-IRMS）；Honey；Adulteration；δ13C value

蜂蜜是一種高品質的天然甜味劑，是由蜜蜂從花蜜或蜜露中生產出來的。蜂蜜主要含葡萄糖、果糖和蔗糖，還含有豐富的蛋白質、氨基酸、有機酸及多種維生素和礦物質等，特別含有多種活性酶類，如淀粉酶、蔗糖轉化酶、過氧化氫酶和脂酶等。因此，蜂蜜是一種富有營養價值的天然食品[1]。近年來隨著人民生活品質的提高，蜂蜜在國內外需求量不斷增大。據統計，我國蜂蜜每年的銷量遠大于產量，蜂蜜摻假摻雜行為確實存在，尤以內銷蜂蜜更為嚴重，且呈不斷加重趨勢。蜂蜜真實性鑒別成為當前急需解決的技術問題。

目前，測定蜂蜜摻假的主要方法有液相色譜示差折光檢測法、薄層色譜法（TLC法）、糖類指紋圖譜法、元素分析同位素比值質譜法和離子色譜法等[2]。對于目前市面上的摻假手段，如在蜂蜜中加入C-3或C-4植物糖漿，上述方法總有些局限性，耗時長、干擾多、靈敏度不高。

利用穩定同位素技術鑒定蜂蜜摻假問題越來越得到商檢質檢等檢測機構的關注。隨著穩定同位素比質譜技術的發展，以及連續流在線裝置的集成化、多功能化和多樣化，穩定同位素分析結果成為快速評鑒蜂蜜是否摻假的有力證據。液相色譜-同位素質譜法（LC-IRMS）采用液相色譜分離蜂蜜中的糖，測定蜂蜜中各種糖組分的δ13C值，測定結果與純正蜂蜜中各糖組分的δ13C值做對比，用來鑒別蜂蜜的真假，提高了試驗效率和靈敏度。筆者采用LC-IRMS對62個蜂蜜樣品進行了檢測，旨在為蜂蜜摻假監控與管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。

DELTA V Advantage同位素質譜儀（Thermo Fisher公司）；UltiMate3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher公司）與Isolink接口；Phenomenex Rezek RCM（Ca2+）色譜柱（300 mm × 8 mm，Thermo Fisher公司）；0.45 μm 水相濾膜。

1.1.2 試劑。

4% Na2S2O8溶液和4% H3PO4溶液；超純水（Millipore公司）；He（高純99.999%，載氣）；CO2（工作標準參考氣）；蔗糖標準品；δ13C標準品（Caffeine）水溶液。

1.1.3 樣品。蜂蜜樣品：來自日常抽檢樣品（共62個樣）。

1.2 樣品處理

稱取0.5 g蜂蜜樣品，用超純水溶解，定容至50 mL，過0.45 μm水相濾膜到進樣瓶中供液相色譜-同位素質譜儀測定。

同一蜂蜜樣品分別配制成1、10 g/L蜂蜜稀釋液，用于蜂蜜中果糖/葡萄糖δ13C和二糖/三糖δ13C的測定。

1.3 色譜和質譜條件

1.3.1 色譜條件。

色譜柱為Phenomenex Rezek RCM（Ca2+），洗脫劑為100%超純水，流速為30 μL/min，樣品溶液進樣體積為10 μL，柱箱溫度為70 ℃。Acid Pump（H3PO4）和Ox.-Pump（Na2S2O8）流速均控制在40 μL/min。

1.3.2 質譜條件。

氧化爐溫度99.9 ℃；離子源：電子轟擊離子源；轟擊電壓120.8 eV；掃描方式：正離子掃描；輔助氣壓力0.4 MPa；離子源電壓2.97 kV；真空度2.0×10-4 Pa。進樣品測定時，每個樣品的分析起始階段和尾氣階段通入CO2參考氣進行系統穩定性評價。如果m/z 44信號在1～2 V或更低，則CO2的本底測試通過[3]。如果m/z 32信號在8～12 V，則O2的本底測試通過。

2 結果與分析

2.1 液相色譜-同位素質譜法分析蜂蜜樣品中各類糖組分的δ13C值

如果蜂蜜是單一花種的純正蜂蜜，其中含有果糖、葡萄糖、二糖和三糖的碳同位素值應十分接近。根據Elflein等[4]和Simsek等[5]的研究報道，真實純蜂蜜樣品各類糖組分的δ13C值在-28.2‰～-22.5‰，葡糖糖和果糖的δ13C值的差值為±1‰，果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值與最小值的差值小于2.1‰，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）為-1‰～1‰。

由表1可知，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不在-1‰～1‰的有5、6、7、47號等9個樣品，其中δ13C差值最小為2.4‰，最大為3.5‰，屬于有摻假樣品，這9個有摻假的樣品經過其他方法提取時發現屬于無蛋白或超低蛋白樣品，由此判定若蜂蜜中無蛋白，那這種蜂蜜極可能為假蜂蜜。而蜂蜜中各種糖組分最大值與最小值的差值（δ13CMax - δ13CMin） < 2.1‰的有12、14、17、44、56等22個樣品，也屬于摻假樣品，其中差值最大的達7.99‰，在這些樣品中，還有15、17、18、44這4個樣品檢測出寡糖，而真實蜂蜜中是不得檢出寡糖的[6]，所以這些樣品都存在摻假摻雜。結果顯示，檢測樣品中共有30個摻假樣品，占62份蜂蜜樣品總數的48.38%，并且凡是樣品蜂蜜中果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不合格的，各種糖組分的差值（δ13CMax - δ13CMin）也不合格；但蜂蜜中各種糖組分的差值（δ13CMax - δ13CMin）不合格的，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）可能合格，也可能不合格[7]。說明目前的摻假手段大多是針對二糖、三糖甚至寡糖的摻假，也就是直接加入了C-3植物源糖漿來摻假。

2.2 LC-IRMS法在蜂蜜摻假中的檢測應用

圖1為使用LC-IRMS方法測定蜂蜜中各種糖組分的δ13C的離子流強度-時間圖譜。蜂蜜試樣中的各種糖組分經過HPLC在線分離和LC IsoLink濕化學氧化，轉化為CO2，分別進行同位素比質譜分析，在譜圖上均顯示為尖峰。譜圖上顯示純正蜂蜜中三糖在1 000 s附近出峰，二糖在1 100 s附近出峰，葡萄糖在1 300 s附近出峰，果糖在1 700 s附近出峰。

應用該方法檢測來自7個不同企業共計62個抽檢樣品（生產日期在2015年12月至2016年6月）中，共有30個樣品不合格，摻假占總數的48.38%；而利用已有的高效液相示差法分析蜂蜜中還原糖及蔗糖含量，結果顯示只有3個樣品不合格，占樣品總數的4.84%；利用薄層色譜法（TLC法）測定蜂蜜中的高果淀粉糖漿，結果顯示有16個樣品不合格，占樣品總數的25.81%。說明應用LC-IRMS法在蜂蜜中的摻假檢出率遠高于原有的方法。且這些企業對檢測結果沒有提出申訴異議，說明該方法準確有效。

2.3 LC-IRMS法測定精度

在每次檢測蜂蜜樣品同時測定蜂蜜平行樣品，測定62個蜂蜜平行樣品各種糖組分的δ13C值，計算標準偏差。由表2可知，LC-IRMS方法測定蜂蜜中各種糖組分δ13C值標準偏差為0.1‰～0.4‰。二糖和三糖標準偏差比果糖、葡萄糖高些，是由于二糖和三糖在蜂蜜中含量相當低，所以要用10 g/L蜂蜜稀釋液進行測定，而果糖、葡萄糖的含量相對高些，所以用1 g/L蜂蜜稀釋液進行測定，同時溫度、濕度、色譜分離效果、系統不穩定等因素也

存在造成偏差增大的可能性[8]。對于日常蜂蜜分析，LC-IRMS法完全可以滿足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的測定。

3 結論

利用LC-IRMS法來檢測隨機抽樣的62個蜂蜜樣品，對蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值進行測定，結果發現30份存在摻假摻雜，占總數的48.38%。摻假手段大多是針對C-3植物源的葡萄糖、果葡萄糖漿甚至多種物質混合摻假，更具隱蔽性，同時突出該方法的優越性和準確性。摻假蜂蜜在市場上大量存在，形式多樣，應加強監控和管理。

參考文獻

[1] 費曉慶，吳斌，沈崇鈺，等.液相色譜/元素分析 同位素比值質譜聯用法鑒定蜂蜜摻假[J].色譜，2011，29（1）：15-19.

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[3] 丁濤.液相色譜-同位素質譜聯用法在蜂蜜摻假鑒定方面的應用[C]//第四屆華東地區色譜、質譜學術報告會論文集.無錫：江蘇省分析測試協會，2010.

[4] ELFLEIN L，RAEZKE K P.Improved detection of honey adulteration by measuring differences between 13C/12C stable carbon isotope ratios of protein and sugar compounds with a combination of elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry and liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry （δ13C-EA/LC-IRMS）[J].Apidologie，2008，39（5）：574-587.

[5] SIMSEK A，BILSEL M，GREN A C.13C/12C pattern of honey from Turkey and determination of adulteration in commercially available honey samples using EA-IRMS[J].Food chemistry，2012，130（4）：1115-1121.

[6] PADOVAN G J，DE JONG D，RODRIGUES L P，et al.Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotopic ratio[J].Food chemistry，2003，82（4）：633-636.

[7] 黃文誠.用不同的方法檢測高果糖玉米糖漿摻假的蜂蜜[J].中國蜂業，2009，60（9）：51-52.

[8] 羅東輝，羅海英，冼燕萍，等.同位素質譜聯用技術鑒別無蛋白蜂蜜的真實性[J].現代食品科技，2012，28（7）：862-866.