離子注入不動桿菌的降解特性

馬睿 蔡長龍 梁海鋒 嚴(yán)一心

摘要 [目的]選育能夠高效降解石油烴的不動桿菌。[方法]采用低能N+對不動桿菌菌株a8進行誘變，測量離子注入前后不動桿菌對石油烴的降解率，并研究其降解能力和降解機理。[結(jié)果]當(dāng)N+的注入能量和注入劑量分別為15 keV和8.0×1015 ions/cm2時，不動桿菌的降解率可提高至95.03%；利用該注入?yún)?shù)對出發(fā)菌種a8進行3次連續(xù)誘變后，獲得1株能有效降解59種烷烴的突變菌株AQ-15；結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對AQ-15降解長鏈?zhǔn)屯闊N的酶AlmA基因進行分析，發(fā)現(xiàn)酶結(jié)合位點之一的47th氨基酸由原來的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G），從而提高了酶的活性，達(dá)到了高效降解長鏈?zhǔn)屯闊N的效果，揭示了離子注入后不動桿菌降解率提高的機理。[結(jié)論]選育出1株能夠高效降解石油烴的不動桿菌菌株AQ-15。

關(guān)鍵詞 離子注入；不動桿菌；降解率；降解機理

中圖分類號 X172 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0001-03

Degradation Characteristics of Ion Implantation Acinetobacter

MA Rui， CAI Chang-long， LIANG Hai-feng et al

（Xian Technological University， Ion Beam Bioengineering and Biodiversity Research Center， Xian， Shaanxi 710021）

Abstract [Objective] The aim was to screen out Acinetobacter strains which could effectively degrade petroleum hydrocarbons. [Method] We mutated Acinetobacter strain a8 by low energy N+， measured degradation rate of Acinetobacter strain a8 to petroleum hydrocarbons before and after ion implantation， and studied its degradation ability and degradation mechanism. [Result] When the injection energy and injection dosage were 15 keV and 8.0×1015 ions/cm2 respectively， the degradation rate of Acinetobacter reached 95.03%； through three continuous mutation of start strain a8 under above injection parameters， a mutant strain AQ-15 which could effectively degrade 59 kinds of alkanes were obtained. The AlmA gene of AQ-15 to degrade long chain paraffin oil was analyzed by combining molecular biology techniques， and it was found that 47th amino acids changed from aspartic acid （Asp，D）into glycine （Gly，G）， and enzyme activity was improved to get target of effectively degrading long chain paraffin oil， which revealed the improvement mechanism of degradation rate of Acinetobacter after ion implantation. [Conclusion] A Acinetobacter strain AQ-15 which could effectively degrade petroleum hydrocarbons was screened out.

Key words Ion implantation；Acinetobacter；Degradation rate；Degradation mechanism

石油類產(chǎn)品是重要的能源和工業(yè)原料，隨著其使用范圍的不斷擴大，石油類產(chǎn)品的排放物對土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞問題也日益凸顯，石油污染治理刻不容緩[1]。科研工作者提出了一系列治理石油污染的技術(shù)，包括物理、化學(xué)、生物等方式，其中，生物治理依據(jù)微生物能以烴類為唯一碳源和能源生長，將烴降解成對環(huán)境無害的產(chǎn)物 CO2和H2O的特點，相比物理、化學(xué)治污具有安全、效果好、成本低、處理徹底、無二次污染等優(yōu)點，是一種經(jīng)濟效益和環(huán)境效益俱佳并且能解決復(fù)雜環(huán)境污染問題的有效治污手段[2]。目前已有多個菌種被證實能夠降解石油烴，周常義等[3]從受污海水中篩選出能以0#柴油為唯一碳源的不動桿菌，該菌株在最適pH 7.0、溫度28 ℃條件下，經(jīng)過3 d培養(yǎng)，其降解率僅為38.7%～56.2%。張子間等[4]從石油污染的土壤中分離篩選出1株能夠降解石油烴的綠葉假單胞菌，并采用10 mV的He-Ne激光進行輻照，誘變選育出1株高效降解石油烴的不動桿菌，其在最適生長條件下，比未受輻照的菌株降解相同石油烴縮短24 h。因此，采用新技術(shù)誘變選育高效石油烴降解菌株是推廣微生物治理生態(tài)環(huán)境的當(dāng)務(wù)之急。

離子注入誘變育種是將一定能量的離子束射入生物體內(nèi)，通過入射離子的能量、質(zhì)量、動量和電荷4種因素作用，引起生物體細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)使基因產(chǎn)生突變，再從這些變異的種子中篩選出正性變異種類，經(jīng)過培育而成為新品種的一項技術(shù)。該技術(shù)具有變異頻率高、變異譜寬、變異快、變異穩(wěn)定可靠等優(yōu)點[5]。筆者從長慶油田的含油污泥中篩選、鑒定出1株不動桿菌，采用離子注入技術(shù)對其誘變，測定了離子注入前后不動桿菌對石油烴的降解率，通過連續(xù)注入低能N+培育出1株不動桿菌菌株，利用GC-MS法對其降解特性和降解能力進行了研究，并通過不動桿菌基因組測序，揭示了其降解率提高的機理，最終獲得了1株高效降解石油烴的不動桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

從陜西省長慶油田附近提取的含油污泥中篩選出1株能以原油為唯一碳源生長的菌株a8，通過分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）。

1.1.2 培養(yǎng)基。

無機鹽溶液：K2HPO4 5.00 g/L，（NH4）2SO4 1.00 g/L，MgSO4 0.25 g/L，NaNO3 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，K2HPO4·3H2O 1.00 g/L，pH 7.0～7.2。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，酵母粉 5.00 g/L，pH 7.0～7.2。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：K2HPO4 0.50 g/L，CaCl2 0.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NH4NO3 1.00 g/L，F(xiàn)eCl3 0.05 g/L，K2HPO4·3H2O 1.50 g/L，瓊脂粉13.00 g/L，pH 7.0～7.2。原油培養(yǎng)基：無機鹽溶液中添加原油2%，pH 7.0～7.5；原油來自于長慶油田（C15～C28，黏度為128 mPa·s）。

1.1.3 儀器。采用四川成都同創(chuàng)材料表面新技術(shù)工程中心研制的生物改性離子注入設(shè)備，該設(shè)備的氣體離子源加速電壓為10～70 kV連續(xù)可調(diào)，最大束流為8 mA，束斑直徑≥100 mm。試驗中高純氮氣流量為6 sccm，工作氣壓為1.3×10-3 Pa，加速電壓為15～20 kV，注入劑量為2.0×1015～12.0×1015 ions/cm2可調(diào)，燈絲電流為10 A，引出電壓為60 V，抑制電壓為1 kV。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化與分離。

將分離保藏的出發(fā)菌株a8置于LB固體培養(yǎng)基上30 ℃活化24 h后，觀察其生長形態(tài)。挑取活化后的菌落接種到液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并于30 ℃、110 r/min條件下培養(yǎng)16 h得1#菌液。

1.2.2 離子注入不動桿菌。

取適量1#菌液，加入無菌水稀釋至濃度為1.0×107 CFU/mL，取0.1 mL菌液均勻涂布于無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，以N+為低能離子注入源，注入能量為15 keV，注入離子劑量分別為0和8.0×1015 ions/cm2。離子注入采用間隔式注入方式，每注入4 s后停止5 s，重復(fù)上述注入模式，直到達(dá)到所要求的注入劑量。注入后，注入劑量為0的記為M0-a8平皿，注入劑量為8.0×1015 ions/cm2的記為M0-A8平皿。取1.0 mL無菌水至注入平皿中心，用無菌刮鏟反復(fù)洗脫；取0.1 mL洗脫液涂布于已經(jīng)準(zhǔn)備好的原油培養(yǎng)基平板上，用無菌鏟涂抹均勻；將M0-a8平皿和M0-A8平皿上培養(yǎng)的不動桿菌培養(yǎng)24 h后，分別挑選菌體生長快、透明圈大的2個單菌落點接于含烴平皿上，記為M1代，編號分別為M1-a81、M1-a82（注入劑量為0），M1-A81、M1-A82（注入劑量為8.0×1015 ions/cm2）。

1.2.3 GC法石油烴降解率測定。

分別將存活的M1-a81、M1-a82、M1-A81、M1-A82不動桿菌按5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有2%原油的液體培養(yǎng)基的三角瓶中（以石油烴為唯一碳源），置于往復(fù)式振蕩器上，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，將不同菌株的上清液倒入相應(yīng)編號的分液漏斗中，加入50.0 mL二氯甲烷，振蕩萃取，重復(fù)該萃取過程3次，收集二氯甲烷層，40 ℃蒸發(fā)至近干，置于比色管中定容至5.0 mL。以不接種的含相同石油烴濃度的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基為對照（CK）。用GC9160氣相色譜儀分析并計算石油烴降解率。

GC9160氣相色譜分析條件：檢測器FID，載氣N2，色譜柱DB-5，進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度300 ℃。升溫程序：40 ℃，保持5 min；100 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min；200 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min；300 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min。

1.2.4 高效降解不動桿菌菌株培育。

以菌株a8為出發(fā)菌株，以離子注入劑量8.0×1015ions/cm2和注入能量15 keV為注入?yún)?shù)，對該菌株進行3輪低能N+注入誘變、培育，獲得1株高效降解長鏈?zhǔn)蜔N的菌株，命名為AQ-15。

1.2.5 GC-MS法石油烴降解譜測定。

以出發(fā)菌株a8為對照，利用GC-MS法分析菌株a8與菌株AQ-15降解譜的變化。將AQ-15接入液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)96 h，用正己烷萃取發(fā)酵液，進行GC-MS殘油組分檢測分析。

取重量法中定容后溶液1.0 mL稀釋100倍作為檢測樣品。氣相色譜儀條件：毛細(xì)管色譜柱RTX-5SM，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm，長度20 m，柱溫采用多階段程序升溫，初溫60 ℃，保持5 min，4 ℃/min升至130 ℃，保持2 min，再以12 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，最后以7 ℃/min升至280 ℃，保持10 min，進樣溫度260 ℃，載氣為高純氦，恒流流量1 mL/min，分流比5∶1，進樣量1 μL。質(zhì)譜儀條件：電離方式為電子轟擊（EI+），電離能量70 eV，離子源溫度200 ℃，檢測溫度250 ℃。

1.2.6 不動桿菌降解機理研究。

利用生物信息學(xué)分析不動桿菌降解機理，設(shè)計引物（正向引物：5′-atgcctgtcgaacacctgga-3′；反向引物：5′-tcaacccagcgcgtgcaccg-3′），分別以A-8和AQ-15菌株基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：模板（約60 ng/μL）2.0 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4.0 μL，緩沖液 5.0 μL，正反向引物（20 μmol/L）各2.0 μL，3 U Taq DNA聚合酶 1.0 μL，ddH2O 35.7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；52 ℃ 2 min；72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖DNA回收后測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行分析并翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)三維結(jié)果模擬由I-TASSER在線服務(wù)系統(tǒng)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不動桿菌的鑒定

對出發(fā)菌a8在30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色圓形，不透明，邊緣不光滑，表面扁平。生理生化試驗結(jié)果表明，a8為革蘭氏陰性細(xì)菌，氧化酶接觸呈陽性，淀粉水解呈陽性，好氧，對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，該菌株特征與不動桿菌屬一致。

2.2 離子注入前后不動桿菌的降解率

由表1可知，菌落M1-A82的降解率最高，達(dá)95.03%，結(jié)合對二氯甲烷萃取液分液前的觀察， M1-A82菌株的有機相顏色最淺，說明該菌的發(fā)酵液中殘留的石油烴相對較少，該菌對石油烴的降解能力最強。

2.3 高效降解不動桿菌的降解特性

采用GC-MS對出發(fā)菌株a8和誘變菌株AQ-15處理的石油殘油組分進行分析。由圖1、2可知，出發(fā)菌株的原油中含有C8～C36的多種烷烴，而誘變菌株降解后的殘油組分中只能檢測少量的長鏈烷烴，降解效果明顯，表明誘變菌株具有高效降解長鏈烷烴的能力。

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，出發(fā)菌株a8可以完全降解29種化合物，而誘變后得到的菌株AQ-15可以降解59種化合物，比出發(fā)菌株能多降解30種化合物，降解能力大幅度提高。

2.4 離子注入不動桿菌的降解機理

根據(jù)現(xiàn)有研究報道，在石油降解菌的烷烴降解酶系統(tǒng)中，降解長鏈烷烴主要為長鏈烷烴羥化酶AlmA[6]。為闡明突變菌株高效降解長鏈?zhǔn)屯闊N的分子機理，依據(jù)不動桿菌基因組測序結(jié)果，經(jīng)分析后AlmA長鏈?zhǔn)屯闊N酶基因全長為1 500 bp，編碼500個氨基酸，其基因序列經(jīng)Blast比對后，同源性與NCBI中報道基因相似度為98%，誘變前后AlmA降解酶DNA序列及蛋白質(zhì)序列比較如圖3所示，其中Sbjct為出發(fā)菌株，Query為誘變菌株，根據(jù)比對結(jié)果可知，突變位點發(fā)生在成熟肽區(qū)域，經(jīng)誘變后140th核苷酸由原來的A變?yōu)镠，相應(yīng)的47th氨基酸由原來的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G）。其酶的一個結(jié)合位點為Asp47。由此可知，天冬氨酸為極性帶負(fù)電荷酸性氨基酸，而甘氨酸為非極性氨基酸，且突變位點發(fā)生在酶結(jié)合位點Asp47，說明突變可能改變了結(jié)合位點結(jié)構(gòu)，使得酶活性有所提高。

3 結(jié)論

將低能N+注入不動桿菌菌株a8，測定了N+注入前后不動桿菌的降解率，當(dāng)N+的注入能量和注入劑量分別為15 keV和8.0×1015ions/cm2時，不動桿菌的降解率有所提高，可達(dá)95.03%；利用上述離子注入?yún)?shù)對出發(fā)菌種a8經(jīng)過3次連續(xù)誘變，篩選培育后獲得了1株降解長鏈?zhǔn)屯闊N能力較高的突變菌株AQ-15，該菌株能有效降解59種烴烷；以AQ-15為研究對象，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對其降解長鏈?zhǔn)屯闊N的酶AlmA基因進行分析，結(jié)果表明酶結(jié)合位點之一的47th氨基酸由原來的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G），從而提高了酶的活性，達(dá)到了高效降解長鏈?zhǔn)屯闊N的效果，揭示了離子注入后不動桿菌降解率提高的機理。

參考文獻

[1] 陳麗華.黃土塬石油污染土壤的降解規(guī)律及生物修復(fù)優(yōu)化研究[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)，2012：1-3.

[2] 孫國華，任利華，劉愛英，等.一株石油烴降解菌分子鑒定及特性分析[J].生物技術(shù)通報，2010（9）：210-214.

[3] 周常義，林情員，蘇國成，等.一株海洋石油烴降解菌的分離鑒定及特性研究[J].集美大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，14（1）：20-24.

[4] 張子間，劉勇弟，盧杰，等.He-Ne激光誘變選育高效石油烴降解菌的研究[J].環(huán)境工程學(xué)報，2012，6（2）：677-682.

[5] 余增亮.離子束生物技術(shù)引論[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[6] 吳福順.渤海溢油區(qū)石油降解菌的篩選鑒定及功能基因研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2013：20-22.