氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內毒素作用下人牙周膜細胞堿性磷酸酶活性的影響

汪義永， 陳 凌， 魏 斌， 吳 贇

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氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內毒素作用下人牙周膜細胞堿性磷酸酶活性的影響

汪義永， 陳 凌， 魏 斌， 吳 贇

目的 研究氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內毒素(Pg-LPS)作用下人牙周膜細胞(PDLC)堿性磷酸酶(ALP)的活性及其表達的影響。 方法 采用細胞培養技術分離PDLC，對照組為僅含1%胎牛血清的細胞培養液，實驗組分別加入不同濃度的氧化苦參堿溶液和Pg-LPS。采用細胞培養技術和酶聯免疫、實時熒光定量RT-PCR技術，觀察Pg-LPS對PDLC的ALP活性及其表達的影響。 結果 在25 μg/mL的Pg-LPS作用下，PDLC的ALP活性及其表達明顯減低，加入一定濃度的氧化苦參堿溶液后，PDLC的ALP活性及其表達有一定程度恢復。 結論 氧化苦參堿可以減輕Pg-LPS對PDLC的破壞，對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性及其表達的現象具有拮抗作用。

氧化苦參堿； 內毒素類； 牙齦/微生物學； 擬桿菌屬； 牙周膜/細胞學； 堿性磷酸酶

研究表明，體外培養的人牙周膜細胞(periodontal ligament cell, PDLC)具有成骨細胞樣特性，牙齦卟啉菌內毒素(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, Pg-LPS)是破壞牙周支持組織的重要致病物質，可抑制PDLC的堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, ALP)活性，對PDLC的分化產生嚴重影響，造成牙周膜的修復過程不能正常進行[1-2]。氧化苦參堿是從中藥苦參中提取的有重要藥理活性的成分，已有多類制劑被研發，并廣泛應用于抗炎、抗病毒、抗腫瘤及免疫治療等方面，具有良好的應用前景。現本課題組通過觀察氧化苦參堿對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性及其表達的影響，研究其是否能夠對抗Pg-LPS對牙周組織的破壞，為氧化苦參堿用于牙周病防治的可能性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細胞培養液、新生牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司)；雙抗(青霉素：100 U/mL；鏈霉素：100 μg/mL，美國Hyclone公司)；PBS(杭州吉諾生物科技有限公司)；Triton X-100(華美生物工程公司)；ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Pg-LPS(晶美生物工程公司)；氧化苦參堿(陜西惠科生物工程)。

1.2 方法

1.2.1 PDLC分離培養 健康雙尖牙4顆(無牙體牙髓及牙周病變)，置于4 ℃的含雙抗的平衡鹽溶液中，在超凈工作臺內用PBS沖洗牙根表面血污，用功刮勺刮去牙根中1/3的牙周膜，再用0.2%的Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化40 min，加入4 mL含20%新生牛血清的DMEM培養液(37 ℃、體積分數為0.045的CO2)進行培養。使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長及形態變化，當細胞鋪滿孔底的60%～80%，消化傳代培養，免疫組織化學法鑒定組織來源，礦化誘導后茜素紅染色觀察礦化結節的形成情況，取4～6代細胞用于實驗。

1.2.2 氧化苦參堿對Pg-LPS作用下PDLC的ALP活性的影響 將生長狀況良好的第4代PDLC用胰酶-EDTA消化后計數，調整細胞濃度，接種于96孔培養板。接種細胞濃度為1×105mL-1，待細胞貼壁后在無菌超凈工作臺內棄去上清，PBS清洗3次，并分為5組，每組設6個復孔。A組為空白對照組，僅含1%新生牛血清的DMEM培養液；B組為25 μg/mL的Pg-LPS刺激組；C組為25 μg/mL的Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿；D組為25 μg/mL的Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿；E組為25 μg/mL的Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿。去除培養液，PBS洗3次，每孔加入0.1% Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱過夜。觀察已無完整細胞結構后，吹打，按ALP試劑盒說明書操作，加入緩沖液50 μL，基質液50 μL，底物100 μL，37 ℃孵育30 min，酶聯儀于520 nm下測吸光度值。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR檢測ALP mRNA的表達水平

1.2.3.1 細胞RNA的提取 將生長狀態良好的第4代PDLC傳入25 cm2的培養瓶，按上述分組連續培養24 h，使用Trizol RNA提取液提取PDLC中的RNA。取適量的RNA分別進行定量與瓊脂糖凝膠電泳，鑒定提取效果。

1.2.3.2 逆轉錄 樣本cDNA合成，反應體系如下：逆轉錄Buffer 2 μL，上下游引物均為0.2 μL，dNTP 0.1 μL，逆轉錄酶0.5 μL，DEPC水5 μL，RNA模板2 μL，總體積10 μL。加入逆轉錄酶之前，先于70 ℃下干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致。加逆轉錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min。取出后立即于95 ℃下干浴3 min，得到逆轉錄終溶液，即cDNA溶液，保存于-80 ℃待用。

1.2.3.3 熒光定量PCR檢測

1.2.3.3.1 GAPDH陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011mmol/L，反應前取3 μL，按10倍稀釋(加水27 μL并充分混勻)為1010mmol/L，依次稀釋至109,108,107,106,105及104mmol/L，備用。

1.2.3.3.2 采用TAKARA SYBR Green染料法對PCR反應進行熒光定量檢測，反應體系共50 μL，其中：模板5 μL，上下游引物各0.8 μL， SYBR Green PCR Mix 25 μL， ddH2O 18.4 μL，進行PCR循環，反應條件為：95 ℃ 60 s→95 ℃ 15 s→60 ℃ 15 s，共40個循環。

GAPDH引物：

上游：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′

下游：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′

ALP引物：

上游：5′-ACCATTCCCACGTCTTCACATTT-3′

下游：5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′

1.2.3.4 Real-Time PCR結果分析 使用熒光定量PCR分析軟件，根據陽性內參模板GAPDH制作標準曲線，對ALP cDNA擴增后產物進行定量分析，作為mRNA表達水平的相對值。

2 結 果

2.1 體外培養PDLC培養礦化能力檢測 培養6 d后組織塊周圍見細胞爬出，呈長梭形或星形(圖1A)。培養時間增長，見礦化誘導液培養組的胞密度逐漸增大，出現不透光黑色結節并逐漸增大(圖1B)；茜素紅染色后可見礦化誘導液實驗組形成多處紅染礦化結節，顯示為鈣鹽沉積部位(圖1C)。

A：人牙周膜細胞；B：礦化誘導液培養；C：茜素紅染色.圖1 人牙周膜細胞及其培養礦化檢測Fig 1 Human periodontal ligament cells mineralization

2.2 不同濃度氧化苦參堿對Pg-LPS作用下PDLC的ALP活性的影響 25 μg/mL的Pg-LPS能夠有效降低PDLC的ALP活性，而加入不同濃度氧化苦參堿后，ALP的活性均有所提高(表1)。

2.3 PCR產物結果 25 μg/mL的Pg-LPS作用于PDLC后，其ALP mRNA的表達明顯降低，與空白對照組比較，差別具有統計學意義(P<0.05)。加入Pg-LPS，并以1，10，25 μg/mL的氧化苦參堿作用，3組PDLC表達的ALP mRNA水平均有所增高，并在一定范圍內隨濃度的增高而增加，加入氧化苦參堿的3個實驗組與僅加入25 μg/mL Pg-LPS的實驗組間比較，差別均具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

表1 不同時間點各組堿性磷酸酶活性

Pg-LPS：牙齦卟啉菌內毒素. A：空白對照組； B：Pg-LPS刺激組； C：Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿； D：Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿； E：Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿. 與B組比較，☆：P<0.05.

Pg-LPS：牙齦卟啉菌內毒素. A：空白對照組； B：Pg-LPS刺激組； C：Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿； D：Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿； E：Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿. 與B組比較，☆：P<0.05.圖2 ALP mRNA與GAPDH吸光度比值Fig 2 The absorbance ratio of ALP mRNA and GAPDH

3 討 論

研究發現，在骨組織的形成、改建和修復的過程中，ALP發揮了十分重要的調節作用。ALP的含量高低代表了組織細胞的分化以及形成骨組織的能力，ALP活性的高低表明骨組織的代謝和改建能力。體外培養的PDLC采用礦化誘導液培養可形成礦化結節，能夠分泌高活性的ALP，表達成骨的相關蛋白和細胞因子，具有成骨細胞的特性。Pg是牙周病的主要致病菌之一，LPS是其主要致病成分，能夠降低PDLC的生物活性，直接破壞PDLC的超微結構，可對PDLC產生不可逆的損傷[3]。近期研究表明，Pg-LPS會明顯抑制PDLC的分化能力，導致其不能向成骨樣細胞分化；還可抑制PDLC表達ALP的活性，這些不良影響將導致牙槽骨的代謝和更新減慢，造成牙周支持組織的破壞，牙周組織的更新和改建過程將無法正常進行[4-5]。研究如何通過藥物拮抗Pg-LPS對PDLC的的破壞，保護PDLC免受Pg-LPS的損傷對牙周病的預防和治療具有重要作用。

氧化苦參堿一直被認為具有抗炎作用，可抑制多種炎癥介質的活性，并影響炎癥過程的各個階段。研究發現，苦參堿及氧化苦參堿等苦豆子生物堿可顯著抑制白三烯的作用，并隨劑量的增大而增強[6]；還可以降低核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)及絲裂原活化蛋白激酶相關的炎癥反應，抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎癥因子的產生[7]。而NF-κB是調控促炎因子產生、激發炎癥反應的重要調控因子。在細胞水平，對于脂多糖刺激后的RAW264.7細胞，氧化苦參堿可抑制NF-κB活化，減少炎性黏附分子和細胞因子的分泌，劑量依賴性地降低炎癥相關因子IL-11、C反應蛋白和TNF-α的表達[8]。說明氧化苦參堿可對抗炎癥反應，對機體及細胞產生保護作用。

本研究結果顯示，濃度為25 μg/mL的Pg-LPS作用于PDLC，其ALP的表達和活性明顯降低，表明該濃度的Pg-LPS對PDLC造成了明顯破壞；分別加入1，10及25 μg/mL的氧化苦參堿后，ALP的表達和活性均有所提高，并隨氧化苦參堿濃度的升高而升高，表明氧化苦參堿對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性具有拮抗作用，在一定范圍內，氧化苦參堿濃度越高，保護作用越好，且在ALP的mRNA表達和蛋白翻譯階段具有同等作用。文獻報道，氧化苦參堿具有很強的藥理活性，對血管內皮細胞、心肌細胞、肝臟細胞等都具有保護作用[9-11]。本研究發現，氧化苦參堿的抗炎及抑制炎癥介質的特性可能同時在牙周發揮相同的作用，它能夠對抗Pg-LPS對PDLC的破壞，促進PDLC的ALP活性，促進其成骨能力，而且這種作用在1～25 μg/mL呈濃度依賴關系，可能的途徑是氧化苦參堿對Pg-LPS導致的炎癥反應發揮相應的對抗作用，需進一步深入研究證實。本研究對氧化苦參堿在牙周組織中的作用進行探討，為牙周病的治療開辟新途徑，提供新的思路。

[1] 申 濤, ?；劬? 簡從相, 等． 改良法分離培養人牙周膜干細胞[J]．華西口腔醫學雜志, 2011,29(1):71-74.

[2] Li X, Zhou L, Takai H,etal. Aggregatibacter actinomycetemcomitans lipopolysaccharide regulates bone sialoprotein gene transcription[J].JCellBiochem, 2012,113(9):2822-2834.

[3] Smith Mac Donald E, Nowzari H,etal. Clinical and microbiological evaluation of a bioabsorbable and a nonresorbable barrier membrane in the treatment of periodontal intraosseous lesions[J].JPeriodontol, 1998,69(4):445-453.

[4] 張風秋. 牙周優勢菌內毒素對人牙周膜細胞的生物學效應及mCD14表達的研究[D]．西安：第四軍醫大學口腔醫學院, 2002.

[5] 田亞光, 廖天安, 陳小濱, 等. 牙髓卟啉單胞菌超聲提取物對成骨細胞周期和凋亡的影響[J]．實用口腔醫學雜志, 2015,31(2):188-191.

[6] 黃秀梅, 李 波. 氧化苦參堿對TNF-α、IL-6和IL-8的影響[J].中成藥, 2003,25(11):903-906.

[7] Dong X Q, Du Q, Yu W H,etal. Anti-inflammatory effects of oxymatrine through inhibition of nuclear factor-kappa B and mitogen-activated protein kinase activation in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells[J].IranJPharmRes, 2013,12(1):165-174.

[8] Yuan X, Sun Y, Miao N,etal. The synergistic anti-inflammatory effect of the combination of sodium ferulate and oxymatrine and its modulation on inflammation-associated mediators in RAW 264.7 cells[J].JEthnopharmacol, 2011,137(3):1477-1485.

[9] 韓延忠, 周永峰, 桑秀秀, 等. 氧化苦參堿對H2O2誘導L02細胞損傷的抑制作用及其機制的研究[J]. 中國中藥雜志, 2016,41(7):1302-1307.

[10] 易 云, 吳 琴, 黃莉萍, 等. 氧化苦參堿對高糖毒性下血管內皮細胞的保護作用[J]. 中國藥理學通報, 2015,31(4):499-503.

[11] 趙 陽. 氧化苦參堿對H9c2心肌細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制[J]. 山東醫藥, 2015,55(37):29-31.

(編輯：何佳鳳)

Effects of Oxymatrine on the Activity of Alkaline Phosphatase in Human Periodontal Ligament Cells Stimulated by Porphyromonas Gingivalis Lipopolysaccharide

WANG Yiyong, CHEN Ling, WEI Bin, WU Yun

Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To study the effect of oxymatrine on the activity of alkaline phosphatase(ALP)and the expression of human periodontal ligament cells (PDLC) stimulated by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS). Method The human PDLC were isolated by cell culture technique. The control group was treated with 1% fetal bovine serum. The experimental groups were treated with different concentrations of oxymatrine solution and Pg-LPS. The activity of ALP and its expression in human PDLC were observed by cell culture and enzyme-linked immunosorbent assay and real time PCR. Results The activity and expression of ALP in human PDLC were significantly decreased at 25 μg/mL Pg-LPS. After addition of oxymatrine solution at a certain concentration, the ALP activity and expression had a certain degree of recovery. Conclusion Oxymatrine can reduce the damage of Pg-LPS on human PDLC and raise the ALP activity and its expression.

oxymatrine; endotoxins; gingiva/microbiology; bacteroides; periodontal ligament/cytology; alkaline phosphatase

2017-02-17

福建省自然科學基金(2017J05124)；中華口腔醫學會口腔疾病與全身疾病關系研究項目(CSA-Y2015-09)

福建醫科大學 附屬第一醫院口腔科，福州 350005

汪義永，男，主治醫師

吳 贇. Email: wuyun488@aliyun.com

R322.41； R378.99； R392.11； R996

A

1672-4194(2017)03-0166-04