萘酚AS-TR磷酸酯法酸性磷酸酶染色在肌病診斷中的應(yīng)用

劉文文， 陳裕慶， 張文敏， 高美欽，2

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萘酚AS-TR磷酸酯法酸性磷酸酶染色在肌病診斷中的應(yīng)用

劉文文1， 陳裕慶1， 張文敏1， 高美欽1，2

萘酚AS-TR磷酸酯； 酸性磷酸酶； 酶組織化學(xué)； 肌疾病

酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)主要位于機體各組織中的溶酶體內(nèi)，吞噬細胞胞質(zhì)內(nèi)也含有豐富的ACP。此酶在酸性條件下催化醇和酚類磷酸酯的水解，最適合的pH為4.8～5.2。顯示ACP的常用方法有Leder and Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法與Holtgn Bitensky改良磷酸鉛法。現(xiàn)筆者選用改良萘酚AS-TR磷酸酯法應(yīng)用于骨骼肌活檢標本的病理診斷中，效果滿意，值得推廣應(yīng)用，現(xiàn)報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2014-2016年臨床送檢的骨骼肌活檢組織共400例，選取其中有代表性的3例。例1為男性，60歲，病理診斷“未見明顯特異性改變”；例2為女性，21歲，病理診斷“多發(fā)性肌炎”；例3為女性，26歲，病理診斷“糖原累積性肌病”。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 酸度計(含數(shù)字式)(PHS-3C，上海第二分析儀器廠)；恒冷切片機(HM 550 OMVPD，美康國際有限公司)；磁力加熱攪拌器(78型，上海市南匯電訊器材廠)。試劑：OCT冰凍切片包埋劑(1603966，德國Leica公司)；異戊烷(14090414)、亞硝酸鈉(20160918)、對品紅(F20111207)及二甲基甲酰胺(T20160913)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；巴比妥鈉(Z6306，成都西亞化工股份有限公司)；醋酸(160223)及鹽酸(150131)(上海西隴化工股份有限公司)；萘酚AS-TR磷酸酯(117K5308V，美國Sigma公司)。

1.2.2 配制試劑 參照文獻[1]的方法配制試劑。4%對品紅鹽酸溶液：對品紅1 g，2 mol/L鹽酸加至25 mL，混合后輕輕搖動使對品紅完全溶解，第2天過濾后使用。4%亞硝酸鈉溶液：亞硝酸鈉40 mg，蒸餾水加至1 mL，每次臨用時配制。六偶氮對品紅溶液：4%對品紅鹽酸溶液6滴，4%亞硝酸鈉溶液1 mL，Michaelis巴比妥醋酸鹽緩沖液(pH=7.6)30 mL。取一潔凈燒杯，先滴入對品紅液6滴，隨后逐滴滴入亞硝酸鈉溶液，邊滴邊充分搖動，靜置2 min使其充分偶氮化，再加入巴比妥醋酸鹽緩沖液30 mL，最后用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH為5.0～5.1。萘酚AS-TR磷酸酯溶液：萘酚AS-TR磷酸酯10 mg，二甲基甲酰胺1 mL，二者混合并稍搖動使其充分溶解。孵育液：萘酚AS-TR磷酸酯溶液1 mL，六偶氮對品紅溶液30 mL，二者充分混合后，調(diào)節(jié)pH為4.8～5.2，用前過濾。

1.2.3 制片及染色方法 肱二頭肌或股四頭肌活檢組織，直徑0.5 cm，長度1 cm，用OCT包埋劑包裹組織，經(jīng)液氮預(yù)冷的異戊烷速凍，用低溫恒冷切片機在-22 ℃下切片，厚度6～8 μm。用電吹風風干組織切片上的水霧，將切片浸入孵育液，于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育。30～60 min后用蒸餾水洗去孵育液，Gill蘇木精染色1 min，流水沖洗15 min。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果 ACP活性細胞質(zhì)呈紅色，胞核藍色，在正常的肌纖維中為陰性，在退變壞死的肌纖維中呈陽性反應(yīng)，在Ⅱ型糖原累積病時也呈陽性反應(yīng)(圖1)。

2 討 論

2.1 染色原理 ACP廣泛分布于機體各個組織，它主要位于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標志酶。在酸性條件下，ACP水解萘酚AS-TR磷酸酯為萘酚AS-TR和磷酸，萘酚AS-TR與六偶氮對品紅偶聯(lián)形成紅色的不溶性復(fù)合物，沉淀在酶活性的部位而顯示出來。此酶在正常的肌纖維中為陰性，溶酶體活躍時，酶活性部位呈紅色，在退變壞死的肌纖維中此酶活性增高顯示陽性反應(yīng)；在酸性麥芽糖酶缺陷導(dǎo)致溶酶體極度活躍的Ⅱ型糖原累積病時呈現(xiàn)陽性，此病的成人型有時糖原的蓄積不太明顯，缺乏特異性肌病理表現(xiàn)，但ACP染色能發(fā)現(xiàn)大量高活性纖維，對診斷有很大幫助；吞噬細胞內(nèi)含有豐富的ACP，呈陽性反應(yīng)；此外，再生纖維及蠟樣脂褐素沉積癥的蓄積物也呈陽性反應(yīng)[1-3]。

A1，A2：正常骨骼肌組織；B1，B2：退變壞死骨骼肌組織； C1，C2：糖原累積性肌病骨骼肌組織.圖1 不同骨骼肌組織的H-E及ACP染色結(jié)果( ×200)Fig 1 H-E and ACP staining results of different skeletal muscle tissues ( ×200)

2.2 注意事項

2.2.1 組織速凍及冷凍切片 為了避免因固定對酶活性的影響，本實驗采用恒冷切片直接顯示酶的方法。應(yīng)注意：(1)肌肉活檢組織應(yīng)及時妥當速凍，防止酶活性的丟失及冰晶形成；(2)切片溫度恰當，一般恒冷室溫度為-22 ℃，凍頭溫度為-20 ℃；溫度太高，切片容易皺折，溫度過低，切片容易產(chǎn)生破洞；(3)切好的組織片應(yīng)置-20 ℃保存，以免酶的擴散或失活，從冰箱取出的切片應(yīng)立即用冷風吹干，以免產(chǎn)生皺折，影響觀察。

2.2.2 試劑配制 (1)4%對品紅鹽酸溶液配置完成后一定要過濾，此溶液置冰箱保存可使用1年以上；(2)4%亞硝酸鈉溶液需臨用前配制；(3)偶氮化過程中2種溶液的順序不能顛倒，否則配制失敗；(4)可用萘酚AS-BI磷酸酯代替萘酚AS-TR磷酸酯；(5)ACP最適合pH值為4.8～5.2，pH值的準確度非常重要。

2.2.3 孵育的溫度及時間 本實驗酶反應(yīng)的最合適溫度為37 ℃，加熱可加快酶反應(yīng)速度，但是過熱會使酶蛋白變性，其反應(yīng)速度反而下降，同時影響酶反應(yīng)結(jié)果[4]。孵育時間一般為30～60 min，因受試劑廠家、批號及操作的影響，應(yīng)根據(jù)實際情況摸索最佳時間。

[1] 梁英杰，凌啟波，張 威. 臨床病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：247-249.

[2] 李作漢，張 平. 神經(jīng)肌肉肌病的臨床與病理[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：23.

[3] 埜中征哉，著. 吳士文，譯. 臨床肌肉病理學(xué)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：29.

[4] 高美欽，張文敏，晉 雯. 還原型輔酶Ⅰ四唑氮還原酶的染色方法[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，36(4)：464.

(編輯：何佳鳳)

2017-01-12

福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.病理學(xué)系，福州 350122；2.科研中心，福州 350004

劉文文，女，助理實驗師，醫(yī)學(xué)碩士

高美欽. Email: gaomq823@sina.com

R345.61； R392.11； R746； R977.3

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1672-4194(2017)03-0202-02