葡萄糖激酶激動劑對胰島α細胞胰升糖素分泌的影響

官濱斌， 劉禮斌

?

葡萄糖激酶激動劑對胰島α細胞胰升糖素分泌的影響

官濱斌， 劉禮斌

目的 探討葡萄糖激酶激動劑(GKA)對胰島α細胞胰升糖素分泌的影響。 方法 (1)αTC1-9細胞株采用0，0.1及1 μmol/L的GKA處理，原代胰島細胞用0，0.5及1 μmol/L的GKA處理，時間均為1 h，檢測低糖刺激的細胞胰升糖素的分泌變化。(2)灌胃法給予SD大鼠0，3及30 mg/kg的GKA處理，分別觀察0，15，30，60及120 min時SD大鼠體內血糖、血漿胰升糖素及胰島素的變化。 結果 (1)αTC1-9細胞株經1 μmol/L的GKA作用1 h后，可顯著降低低糖刺激的胰升糖素分泌，比對照組下降了45.16%。(2)原代胰島細胞經0.5及1 μmol/L的GKA作用1 h后，可顯著降低低糖刺激的胰升糖素分泌，分別比對照組下降了68.7%和84.3%。(3)GKA可劑量依賴性地降低SD大鼠的血糖水平，并可刺激大鼠體內胰島素分泌；3及30 mg/kg的GKA可顯著抑制SD大鼠體內的胰升糖素水平。 結論 GKA可抑制胰島α細胞胰升糖素的分泌，從而改善糖代謝。

葡糖激酶； 葡萄糖/代謝； 胰島/細胞學； 胰升糖素； 胰島素

2型糖尿病是一種以持續性高血糖和脂代謝紊亂為特征的慢性進展性疾病，伴有大血管或微血管并發癥。機體的血糖平衡是由神經及內分泌系統相互協調的結果，一旦平衡被打破便發展為糖尿病。葡萄糖激酶(glucokinase, GK)在維持機體的血糖平衡中發揮著重要作用。GK作為葡萄糖感受器，主要存在于肝細胞和胰島β細胞，也存在于一些神經內分泌細胞，包括α細胞、腸上皮細胞、下丘腦、垂體及腦干的某些神經元細胞。GK基因已被發現大約有600多個突變。當編碼GK的某個等位基因突變時，可引發2型青少年發病的成人型糖尿病；當編碼GK的等位基因遺傳性突變導致GK功能或表達喪失時，將導致GK相關的持續性新生兒糖尿病；當編碼GK的基因突變使得體內GK活性異常升高時，將發生嬰兒持續性高胰島素低血糖癥。因此，調節體內的GK活性可成為治療糖尿病的一個新思路。

GK激動劑(glucokinase activators, GKA)可明顯激活GK的活性，從而改善體內的高血糖狀態。研究發現，GKA可減少氧化應激誘導的β細胞凋亡、增加肝糖原合成、減少肝臟葡萄糖輸出以及增加葡萄糖刺激的胰島素分泌[1]。目前，關于GKA的研究主要集中于肝細胞和胰島β細胞，但在2型糖尿病的發生發展過程中，還伴隨著α細胞功能的紊亂，GKA是否可通過抑制胰島α細胞分泌胰升糖素，從而參與降糖過程？本研究將為GKA治療糖尿病提供理論基礎和新的研發思路。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞、試劑 清潔級8周齡健康雄性SD大鼠24只[許可證號：SCXK(滬)2003-0003，上海斯萊克實驗動物有限責任公司]，體質量(200±25)g。小鼠αTC1-9(美國ATCC公司)；DMEM、1640細胞培養液(美國Gibco公司)；胰升糖素ELISA試劑盒(瑞典Mercodia公司)；胰島素ELISA試劑盒(日本Shibayagi公司)；KRB溶液[NaCl 120、KCl 4.8、CaCl22.5、MgCl21.2、NaHCO33.24(單位：mmol/L)、BSA 1 mg/mL]；GKA藥物粉劑(上海華領醫藥技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 GKA對αTC1-9分泌胰升糖素的影響 將αTC1-9細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液(16.7 mmol/L葡萄糖)的10 cm培養皿中，并置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2細胞孵育箱中，5～7 d傳代1次，待細胞長至70%～80%時，將細胞接種于24孔板。待細胞長至80%左右，用Hank’s液輕洗細胞2次，于37 ℃高糖KRB溶液(7 mmol/L葡萄糖)預培養30 min后，更換為低糖KRB溶液(1 mmol/L葡萄糖)，給予0，0.1及1 μmol/L的GKA(用GKA粉末溶解于低糖KRB溶液中)干預處理1 h，提取KRB溶液上清，-20 ℃保存，用ELISA法測定不同濃度組的胰升糖素水平。計算裂解細胞，檢測蛋白含量，以校正胰升糖素(測得的胰升糖素濃度/蛋白濃度)。每個處理因素設2個復孔，實驗重復3次。

1.2.2 GKA對原代胰島細胞分泌胰升糖素的影響 膠原酶分離大鼠原代胰島細胞，按照每孔20個胰島的密度接種于24孔板中，培養于1640培養液(5.6 mmol/L葡萄糖，10% FBS)修復過夜，用Hank’s液輕洗細胞2次，37 ℃下給予高糖KRB溶液預培養30 min，更換為低糖KRB溶液，給予0，0.5及1 μmol/L的GKA干預處理1 h，其余步驟同1.2.1。

1.2.3 GKA對SD大鼠分泌胰升糖素的影響 SD大鼠18只，隨機分成對照組、GKA(3 mg/kg)組及GKA(30 mg/kg)組(n=6)。大鼠饑餓6 h，采用灌胃法使大鼠服用GKA藥物，并進行藥物耐量試驗，尾靜脈采血，測定不同時間點(0，15，30，60及120 min)的血糖、血漿胰升糖素及胰島素水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。兩樣本均數間比較采用t檢驗，三樣本均數間的兩兩比較采用方差分析LSD-t檢驗，體內實驗部分采用重復測量的方差分析。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 GKA對αTC1-9細胞分泌胰升糖素的影響 在低糖(1 mmol/L)培養條件下，αTC1-9細胞胰升糖素的分泌量為高糖(7 mmol/L)條件下的1.98倍(P<0.05，圖1A)。GKA(0.1 μmol/L)對αTC1-9細胞低糖刺激的胰升糖素分泌無明顯影響，而GKA(1 μmol/L)可顯著降低αTC1-9分泌低糖刺激的胰升糖素分泌，與GKA(0 μmol/L)比較，下降了45.16%(P<0.05，圖1B)。

2.2 GKA對原代胰島細胞分泌胰升糖素的影響 培養原代胰島細胞后胰升糖素的分泌量，低糖條件下為高糖條件下的3.7倍(P<0.05，圖2A)。GKA(0.5，1 μmol/L)可顯著降低原代胰島細胞分泌胰升糖素，與GKA(0 μmol/L)比較，分別下降了68.7%和84.3%(P<0.05，圖2B)。

2.3 GKA處理后大鼠的藥物耐量試驗結果及胰升糖素、胰島素分泌曲線變化 藥物耐量試驗結果顯示，GKA可劑量依賴性地降低SD大鼠的血糖水平。GKA(3 mg/kg)組與對照組比較，灌胃后各時間點(15，30，60及120 min)血糖值差別無統計學意義；而GKA(30 mg/kg)組在給予藥物灌胃30及60 min后的血糖值明顯下降，與對照組比較，分別降低了26.76%和26.47%(P<0.05，圖3A)。GKA(3及30 mg/kg)灌胃后，大鼠體內胰升糖素無明顯的釋放峰值出現(圖3B)，與對照組比較，在給予GKA灌胃2 h后，GKA(3及30 mg/kg)組分別下降86.15%和89.23%(P<0.05)。胰島素分泌曲線提示，GKA可刺激體內胰島素分泌，分泌高峰為藥物灌胃后15 min，此后逐漸減弱(圖3C)。

GKA：葡萄糖激酶激動劑. A：與高糖組比較，☆：P<0.05；B：1 μmol/L的GKA組與0 μmol/L的GKA組比較，☆：P<0.05.圖1 低糖及不同濃度GKA對αTC1-9細胞胰升糖素分泌的影響Fig 1 Effect of low glucose or various concentrations of GKA on glucagon secretion of αTC1-9

GKA：葡萄糖激酶激動劑. A：與高糖組比較，☆：P<0.05；B：不同濃度GKA組與未加GKA組比較，☆：P<0.05.圖2 低糖及不同濃度GKA對原代胰島細胞胰升糖素分泌的影響Fig 2 Effect of low glucose or various concentrations of GKA on glucagon secretion of primary islets

3 討 論

1981年Unger提出了糖尿病發病的“雙激素學說”，認為糖尿病發病是由于胰島α細胞及β細胞功能均發生異常，即胰島素分泌相對不足，胰升糖素分泌相對增高所致[2]。胰升糖素分泌的絕對或相對過多是造成2型糖尿病高血糖的重要原因；1型糖尿病患者內源性胰島素分泌絕對不足，血中胰升糖素水平為正常人的10～15倍，且升糖效應也較正常人高出5～10倍。在糖尿病患者中，α細胞的功能存在明顯異常，表現為低血糖時分泌反應不足，高血糖時分泌不適度的增多。在一項關于青少年1型糖尿病的研究中，餐后血糖與胰升糖素顯著相關，血糖增加10 mmol/L可使胰升糖素相應增加20%[3]。此外，Ward等報道，與正常人比較，2型糖尿病患者的葡萄糖調節作用的敏感性下降，高血糖抑制胰升糖素分泌作用減弱，導致胰升糖素分泌持續增加，引起高胰升糖素血癥，進一步刺激肝糖原分解，使血糖水平進一步升高，形成惡性循環[4]。血糖的穩定有賴于胰升糖素與胰島素的相互協調。在2型糖尿病胰島素分泌相對不足時，抑制胰升糖素仍可改善血糖。因此，阻斷或減少胰升糖素的作用可作為糖尿病新的治療靶點。

GKA：葡萄糖激酶激動劑. A：血糖；B：胰升糖素；C：胰島素. 與對照組比較，☆：P<0.05.圖3 不同濃度GKA對大鼠血糖、胰升糖素和胰島素的分泌的影響Fig 3 Effect of various concentrations of GKA on blood glucose and glucagon or insulin secretion of rats

GKA作為一種降糖新藥，對胰島細胞及肝臟具有雙重降糖作用，不僅可以增加胰島β細胞對葡萄糖的敏感性，促進胰島素的分泌，還可減少2型糖尿病患者肝糖原的分解[5]。許多GKA藥物還顯示出提高葡萄糖刺激胰島素釋放的優勢，在動物實驗中顯示了顯著的降糖效果[6]。之前關于GKA藥物降糖機制的研究并未關注其對體內胰升糖素水平的影響。本研究發現，在體外實驗中，GKA可抑制低糖刺激的αTC1-9細胞及原代胰島細胞胰升糖素分泌；在體內實驗中，GKA呈現劑量依賴性的降糖效應，同時可抑制SD大鼠血漿中胰升糖素水平，實驗過程中胰升糖素未出現明顯的釋放峰值。提示GKA可降低體外細胞模型及體內動物模型的胰升糖素水平。筆者還觀察到，在灌胃法給予SD大鼠GKA藥物15～30 min時，其體內胰島素水平顯著提高，峰值出現于GKA灌胃后15 min。GKA藥物與磺脲類藥物相似，存在大劑量使用時出現的低血糖風險[7]。筆者將在后續的研究中進一步探索GKA藥物是否同樣可降低糖尿病大鼠模型的血糖，同時抑制其體內的胰升糖素水平。

目前，改善α細胞功能的降糖藥主要有噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones,TZD)及人胰升糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)類似物，前者通過抗炎及抗氧化作用降低胰島α細胞的胰島素抵抗，從而改善胰島α細胞分泌功能，而后者與二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制劑除上述的功能外，還具有改善胰島α細胞功能、減少胰升糖素分泌的作用[8]。Takade等發現，小劑量注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)后，小鼠血中胰升糖素水平明顯升高，免疫熒光染色見胰腺組織中胰升糖素和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)雙陽性細胞較正常小鼠增加，而給予DDP-4抑制劑可降低血中胰升糖素的水平，還可使胰升糖素和PCNA雙陽性細胞減少，提示DDP-4抑制劑可顯著抑制STZ小鼠胰島α細胞的增殖和分泌功能[9]。GKA是否可通過抗炎、抗氧化作用減輕胰島α細胞的胰島素抵抗或通過抑制胰島α細胞增殖及其分泌功能，從而改善胰島α細胞功能，仍有待進一步明確。

目前GKA作為抗糖尿病的新藥已進入臨床試驗階段[10-12]。本研究提示，GKA可抑制體內及體外低糖刺激的胰升糖素水平，是對GKA藥物降糖機制的補充。胰島α細胞功能障礙在糖尿病的發生、發展過程中發揮不可忽視的作用，改善胰島α細胞的功能應該成為治療糖尿病的一個重要環節。推測GKA藥物可改善機體糖代謝的部分原因與其能改善胰島α細胞的功能有關，盡管目前具體作用機制尚未明確，相信隨著對GKA類藥物作用機制研究的深入，將突破傳統藥物只改善胰島β細胞的局限性，為糖尿病的治療開辟新的領域。

[1] Nakamura A, Togashi Y, Orime K,etal. Control of beta cell function and proliferation in mice stimulated by small-molecule glucokinase activator under various conditions [J].Diabetologia, 2012, 55:1745-1754.

[2] Unger R H, Orci L. Glucagon and the A cell: physiology and pathophysiology (first two parts) [J].NEnglJMed, 1981,304(25):1518-1524.

[3] Porksen S, Nielson L B, Kaas A,etal. Meal-stimulated glucagon release is associated with postprandial blood glucose level and does not interfere with glycemic control in children and adolescents with new-onset type 1 diabetes[J].JClinEndocrinolMetab, 2007,92(8):2910-2916.

[4] Ward W K, Bolgiano D C, Mc Knight B,etal. Diminished B cell secretory capacity in patients with noninsulin-dependent diabetes mellitus[J].JClinInvest, 1984,74(4):1318-1328.

[5] Efanov A M, Barrett D G, Brenner M B,etal. A novel glucokinase activator modulates pancreatic islet and hepatocyte function[J].Endocrinology, 2005,146:3696-3701.

[6] Futamura M, Yao J, Li X,etal. Chronic treatment with a glucokinase activator delays the onset of hyperglycaemia and preserves beta cell mass in the Zucker diabetic fatty rat[J].Diabetologia, 2012,55:1071-1080.

[7] Tirmenstein M, Horvath J, Graziano M,etal. Utilization of the zucker diabetic fatty (ZDF) rat model for investigating hypoglycemia-related toxicities[J].ToxicolPathol, 2015,43(6):825-837.

[8] Kielgast U, Asmar M, Madsbad S,etal. Effect of glucagon-like peptide-1 on alpha- and beta-cell function in C-peptide-negative type 1 diabetic patients[J].JClinEndocrinolMetab, 2010,95(5):2492-2496.

[9] Takeda Y, Fujita Y, Honjo J,etal. Reduction of both beta cell death and alpha cell proliferation by dipeptidyl peptidase-4 inhibition in a streptozotocin-induced model of diabetes in mice[J].Diabetologia, 2012,55(2):404-412.

[10] Lu M , Li P, Bandyopadhyay G,etal. Characterization of a novel glucokinase activator in rat and mouse models[J].PLoSOne, 2014,9(2): e88431.

[11] Park K, Lee B M, Hyun K H,etal. Design and synthesis of acetylenyl benzamide derivatives as novel glucokinase activators for the treatment of T2DM[J].ACSMedChemLett, 2015,6(3):296-301.

[12] Bonadonna R C, Heise T, Arbet-Engels C,etal. Piragliatin (RO4389620), a novel glucokinase activator, lowers plasma glucose both in the postabsorptive state and after a glucose challenge in patients with type 2 diabetes mellitus: a mechanistic study[J].JClinEndocrinolMetab, 2010,95(11):5028-5036.

(編輯：何佳鳳)

Effect of Glucokinase Activators on α-cell Glucagon Secretion

GUAN Binbin, LIU Libin

Department of Endocrinology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To investigate the effect of glucokinase activators(GKA) on α-cell glucagon releasing. Methods (1) αTC1-9, an α cell line, were incubated with different concentration of GKA(0, 0.1, 1 μmol/L)for 1 h，then the secretion of glucagon stimulated by low glucose were measured. (2) Primary islets were incubated with different concentrations of GKA(0, 0.5, 1 μmol/L)for 1 h，then the secretion of glucagon stimulated by low glucose were measured. (3) SD rats were treated with different concentrations of GKA by intragastric administration, then the blood glucose, plasma glucagon and plasma insulin were detected. Results (1) Exposure of αTC1-9 to GKA(1 μmol/L)for 1 h resulted in a reduction of glucagon secretion, and compared with control group it was reduced by 45.16%. (2) After treated with GKA (0.5, 1 μmol/L)for 1 h，the levels of glucagon in both groups of primary islets were reduced significantly, and compared with control group it was reduced by 68.7% and 84.3%, respectively. (3) The reduction effect of GKA on blood glucose in SD rats was dose dependent. In both the low dose treatment group(GKA 3 mg/kg)and high dose treatment group(GKA 30 mg/kg), plasma glucagon levels were significantly reduced. GKA stimulated insulin secretion in SD rats. Conclusion GKA may improve glucometabolism, which may be due to the inhibition of glucagon secretion.

glucokinase; glucose/metabolism; islets of langerhans/cytology; glucagon; insulin

2016-10-19

福建省自然科學基金衛生聯合資金項目(2016J01547)

福建醫科大學 附屬協和醫院內分泌科，福建省內分泌研究所，福州 350001

官濱斌，男，住院醫師，醫學博士

劉禮斌. Email:Libin.liu@hotmail.com

R-332； R322.57； R343.23； R345.57 ；R587.1； R977.3； R977.7

A

1672-4194(2017)03-0155-04