雷公藤內酯醇對肝癌H22細胞增殖凋亡及COX-2表達的影響

甘陳靈， 鄒玉蓮， 黃秀旺， 許建華

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雷公藤內酯醇對肝癌H22細胞增殖凋亡及COX-2表達的影響

甘陳靈1， 鄒玉蓮2， 黃秀旺1， 許建華1

目的 觀察雷公藤內酯醇(TPL)對肝癌H22細胞增殖、凋亡及環氧合酶-2(COX-2)表達水平的影響。 方法 以體外培養的鼠源性H22細胞株為研究對象，實驗分對照組和不同濃度的TPL處理組。MTT比色法測定TPL對H22細胞株增殖抑制情況；TPL處理48 h后，Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡情況,流式細胞術間接免疫熒光雙標記法檢測COX-2表達變化情況。 結果 隨著藥物濃度的增加及時間的延長，TPL能明顯抑制H22細胞增殖。TPL誘導細胞凋亡及下調COX-2的表達具有濃度依賴性，不同濃度組比較，差別具有統計學意義(P<0.05)。 結論 TPL可能通過誘導肝癌H22細胞凋亡及抑制COX-2表達發揮抗腫瘤作用。

雷公藤內酯； 肝腫瘤； 細胞凋亡； 前列腺素內過氧化物合酶類

環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素合成過程中關鍵的限速酶。研究發現，COX-2在多種腫瘤組織中存在過度表達，并且其持續的高表達可能與腫瘤的發生、浸潤、轉移存在密切的相關性[1-2]。雷公藤內酯醇(triptolide，TPL)是雷公藤的主要有效成分之一，可以誘導腫瘤細胞凋亡，小劑量TPL即可抑制多種腫瘤細胞的生長[3-5]。本研究以肝癌細胞株H22細胞為研究對象，擬探討TPL對肝癌細胞增殖、凋亡及COX-2蛋白表達的影響，旨在探討TPL抗肝癌的作用機制，為TPL抗肝腫瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 鼠源性肝癌細胞H22，由本課題組凍存提供，培養于RPMI 1640培養液中。細胞均置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度培養箱中孵育，取對數生長期細胞用于實驗。

1.1.2 試劑 TPL(南京澤朗生物科技有限公司，純度為99%)，于實驗前以丙二醇(1 mg/mL)新鮮配制，使用時以培養液稀釋至所需濃度(丙二醇終濃度≤0.01%)；丙二醇(國藥集團化學試劑有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清、青-鏈霉素雙抗(美國Hyclone公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(美國羅氏公司)；Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit(美國BD公司)；COX-2多克隆抗體(貨號：12282)及羊抗兔熒光二抗(貨號：4412，美國CST公司)。

1.1.3 儀器 流式細胞儀(FACS Verse，美國BD公司)；多功能酶標儀(Varioskan Flash，德國賽默飛世爾公司)；倒置顯微鏡(BDS200-PH，重慶奧特光學儀器公司)；高速冷凍離心機(5702RH，Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定TPL對腫瘤細胞的增殖抑制率 實驗設8，32，64，128，256 ng/mL 5個濃度處理組，以培養液代替TPL為對照組。取對數生長期的H22細胞分別接種于96孔培養板中，每孔200 μL，調整細胞密度為105mL-1，實驗組分別加入不同濃度的藥物，對照組不加藥，每組設3個復孔，共同孵育24 h或48 h，實驗終止前每孔加入MTT 20 μL，混勻后避光培養4 h，室溫離心棄去上清液，加120 μL DMSO混勻，孵育15 min，各組均于570 nm波長處測定各孔的吸光度OD值，按公式計算細胞生長抑制率，根據GraphPad Prism 6軟件計算其半數抑制濃度(inhibitory concentration 50%,IC50)：

抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%

1.2.2 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測H22細胞的凋亡率 在不同濃度的TPL處理48 h后，收集細胞培養液，離心收集細胞，PBS洗滌2次，Annexin V緩沖液懸浮細胞，按照羅氏公司AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書處理，在1 h內行流式細胞術檢測。細胞凋亡率按以下公式計算：

細胞凋亡率(%)=(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/全部細胞數×100%

結果以Annexin V陽性/PI陰性為早期凋亡，Annexin V陽性/PI陽性為晚期凋亡。

1.2.3 流式細胞術間接免疫熒光雙標記法檢測H22細胞中COX-2蛋白表達 在不同濃度的 TPL作用下，H22細胞加藥處理48 h，收集培養液，室溫離心收集細胞。依據Cell Signaling Technology的實驗手冊以及參照文獻[6]方法并作適當修改，按照BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit操作步驟對細胞進行處理，固定液/破膜液4 ℃孵育細胞25 min后采用間接免疫熒光標記法，將1×105細胞用流式液(含1%胎牛血清的PBS液)洗滌2次，加入10 μL濃度為1∶100的COX-2多克隆抗體，混勻，4 ℃孵育20 min。加入流式液3 mL混勻，離心2 000 r/min，3 min，棄去上清液。加入10 μL濃度為1∶100的羊抗兔二抗進行熒光染色，4 ℃孵育15 min。加入流式液3 mL混勻，離心2 000 r/min，3 min，棄去上清液，加入200 μL流失液懸浮混勻，上機檢測。設置對照樣品：以PBS代替一抗；陽性對照(只加一抗或只加二抗)以及同型對照。運用流式數據分析軟件FlowJo進行分析，COX-2蛋白表達量以COX-2陽性細胞百分率表示。

2 結 果

2.1 MTT法檢測TPL對H22細胞增殖抑制作用 分別用終濃度為8，32，64，128及256 ng/mL的TPL處理H22細胞24，48 h后，隨著藥物濃度的增加及時間的延長，TPL對H22細胞的生長抑制率逐漸增高(圖1)，濃度、時間雙因素方差分析表明，TPL對H22細胞的增殖抑制作用在濃度和時間之間存在交互作用(P<0.01)，說明高濃度TPL長時間作用對H22細胞的抑制作用最強。濃度和時間具有單獨效應，即隨著藥物作用濃度的增加，其增殖抑制作用增強(P<0.01)；隨著作用時間的延長，其抑制作用也增強(P<0.01)，說明TPL對H22細胞的增殖抑制作用在8～256 ng/mL具有濃度依賴性，在24～48 h具有時間依賴性。通過回歸方程求算得24 h的IC50為266.8 ng/mL，其95%的置信區間為78.02～912.6 ng/mL；48 h的IC50為49.26 ng/mL，其95%的置信區間為41.63～58.29 ng/mL。

TPL:雷公藤內酯醇. 與對照組比較，☆：P<0.05， ☆☆：P<0.01， ☆☆☆：P<0.001.圖1 TPL對H22細胞的增殖抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of TPL on proliferation in H22 liver cancer cells

2.2 流式細胞術測定TPL對細胞凋亡的影響 0，12.5，25及50 ng/mL濃度的TPL作用48 h后，H22細胞的總凋亡率分別為(7.21±0.45)%，(39.8±0.72)%，(49.4±2.93)%及(58.5±3.56)%。單因素方差分析表明，藥物濃度對細胞凋亡影響顯著F(3, 8)=273.2，P<0.01，各組之間兩兩比較具有顯著性差別(圖2)。

2.3 流式細胞術測定TPL對COX-2表達的影響 不同濃度的TPL作用48 h后檢測H22細胞COX-2蛋白的表達變化。12.5，25及50 ng/mL TPL處理組H22細胞COX-2蛋白表達水平明顯低于對照組，單因素方差分析表明藥物濃度對COX-2表達影響顯著[F(1.8，8.998)=80.57，P<0.01]。TPL 50,25及12.5 ng/mL組 COX-2蛋白表達水平兩兩比較，差別亦有顯著性，隨著TPL藥物濃度增加，COX-2表達水平降低，提示TPL可抑制肝癌H22細胞COX-2的表達，且其抑制作用具有濃度依賴性(圖3)。

3 討 論

目前認為，腫瘤是一種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，腫瘤細胞就有可能停止生長。傳統化療藥物的細胞毒作用太強，藥物殺傷腫瘤細胞的同時也對機體的正常細胞造成一定程度的損傷。誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物抗腫瘤治療的另一種機制，也成為研發現代抗腫瘤藥物的新策略，從祖國醫學中尋找高效低毒抗腫瘤藥物是目前研究熱點之一。TPL是中藥雷公藤的主要有效成分之一，因其有顯著的抗炎、抗生育以及免疫調節的作用[7-8]，在臨床上得到廣泛的應用。近年來研究發現，TPL具有廣譜高效抗腫瘤作用的特點[9-10]，在較低濃度即可抑制腫瘤細胞的體外增殖和集落形成，治療黑色素細胞瘤效果明顯優于紫杉醇[11]，是有前途的抗腫瘤藥物。Cui等發現，TPL以時間和劑量依賴的方式抑制Raji細胞增殖，24 h的IC50為25 nmol/L，其抑制率呈濃度依賴性[12]。本研究結果表明，TPL對H22細胞48 h的IC50為49.26 ng/mL，說明較低濃度的TPL就可以抑制H22細胞的增殖，且其抑制作用呈濃度、時間依賴性。文獻研究表明，低于25 mg/L TPL處理正常肝細胞24 h后，TPL幾乎沒有表現出肝毒性[13]，由此可見低濃度TPL用于治療肝細胞癌是相對安全的。TPL可通過多種機制發揮抗腫瘤的作用，目前研究表明TPL抗腫瘤作用主要與誘導細胞凋亡有關[14-15]。筆者發現，經TPL作用后腫瘤細胞發生了典型的凋亡變化，提示TPL可以誘導H22細胞凋亡。通過FITC-Annexin V/PI標記流式細胞儀檢測不同濃度TPL作用48 h后H22細胞的凋亡率，單因素方差分析表明，藥物濃度對細胞凋亡影響顯著(P<0.01)，凋亡率隨TPL濃度的增加而提高，結果表明TPL可以顯著誘導H22細胞凋亡。

a：流式細胞術檢測不同濃度TPL處理48 h對H22細胞凋亡的影響； b：不同濃度TPL處理48 h對各凋亡時期細胞凋亡的影響； c：統計分析不同濃度TPL處理48 h對總細胞凋亡率的影響. TPL:雷公藤內酯醇. TPL 0 ng/mL為對照組. 與對照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001.圖2 TPL誘導H22細胞凋亡Fig 2 TPL induces apoptosis in H22 liver cancer cells

a：流式細胞術檢測不同濃度TPL處理48 h后COX-2表達的變化；b：統計分析不同濃度TPL處理48 h后COX-2表達的變化. TPL:雷公藤內酯醇. TPL 0 ng/mL為對照組. 與對照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001.圖3 TPL下調H22細胞COX-2的表達Fig 3 TPL inhibits COX-2 expression in hepatic cancer cell line H22

隨著疾病的進展，凋亡抑制可提高腫瘤細胞的存活力，進而對化療藥物產生耐藥作用。凋亡抵抗也是導致腫瘤細胞耐藥的重要原因[16]。研究表明，COX-2在腫瘤組織中過表達與抑制細胞凋亡作用密切相關，被認為腫瘤化療抵抗的重要原因[17-18]。COX-2是前列腺素合成過程中關鍵的限速酶，COX-2在正常情況下表達極少，當細胞受到炎癥介質、細胞因子等各種刺激后，COX-2可迅速合成參與炎癥過程[19]。COX-2的過度表達與多種腫瘤的發生發展密切相關，提示其可能是具有潛在價值的腫瘤標志，可作為腫瘤治療的新靶點。在動物模型肝癌的研究中發現，肝癌組織中COX-2表達明顯上調，因此，COX-2的表達可作為肝癌惡性程度的一種提示[20]。TPL能夠通過抑制多種腫瘤細胞COX-2表達，進而發揮誘導腫瘤凋亡以及抑制侵襲作用[14，21]。本實驗用不同濃度的TPL處理肝癌H22細胞株，觀察其對COX-2表達水平的影響，對照組H22細胞有較高水平的COX-2表達，12.5，25及50 ng/mL TPL處理組H22細胞COX-2表達水平明顯低于對照組，差別均具有統計學意義(P<0.05)，說明TPL可以抑制肝癌H22細胞COX-2的表達，誘導細胞凋亡從而達到抗肝癌的作用。因此，TPL具有潛在的治療肝癌的臨床應用。

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(編輯:張慧茹)

Effects of Triptolide on Proliferation, Apoptosis, and Cycloxygenase-2 Expression in Hepatic Cancer Cell Line H22

GAN Chenling1, ZOU Yulian2, HUANG Xiuwang1, XU Jianhua1

1. School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China; 2. Institute of Immunotherapy, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To investigate the effects of triptolide (TPL) on proliferation, apoptosis, and cycloxygenase-2 (COX-2) expression in liver cancer line H22 and explore its anti-tumor mechanism. Methods H22 cultured in vitro was treated with different concentrations of triptolide, cell proliferation activity was determined by MTT assay. The Annexin V-FITC/PI cell apoptosis and COX-2 expression were assessed at 48 h after the onset of drug treatment by flow cytometry. Result Triptolide significantly inhibited the proliferation of H22 cells in a dose- and time-dependent manner. In addition, triptolide significantly induced cell apoptosis and down-regulated COX-2 expression in a dose-manner during 48 h. Conclusion TPL may play an anti-liver cancer role by inducing cell apoptosis and inhibiting COX-2 expression in H22 cells.

triptolide； liver neoplasms； apoptosis； prostaglandin-endoperoxide synthases

2017-03-09

福建省自然科學基金(2017J01824)；福建醫科大學苗圃基金(2015MP009)

福建醫科大學，福州 350122 1. 藥學院；2.免疫治療研究所

甘陳靈，男，助理實驗師，理學碩士

許建華. Email:xjh@mail.fjmu.edu.cn

R284.1； R735.7； R977.3

A

1672-4194(2017)03-0146-05