廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌復發患者癌組織中BRCA1、BRCA2的表達變化

林國鴻，農文偉，羅強，周增華(廣西壯族自治區民族醫院·廣西醫科大學附屬民族醫院，南寧530007；廣西醫科大學第二附屬醫院)

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廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌復發患者癌組織中BRCA1、BRCA2的表達變化

林國鴻1，農文偉1，羅強1，周增華2
(1廣西壯族自治區民族醫院·廣西醫科大學附屬民族醫院，南寧530007；2廣西醫科大學第二附屬醫院)

目的 觀察廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌復發患者癌組織中BRCAI與BRCA2表達變化。方法 采用熒光定量PCR和Western blotting法檢測30例首診早發性乳腺癌患者(A組)癌和癌旁組織標本、30例早發性乳腺癌復發患者(B組)癌和癌旁組織標本、10例乳腺增生患者(C組)標本中BRCA1與BRCA2 mRNA及蛋白表達。結果 與C組比較，A、B組癌和癌旁組織標本BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白表達均下降(P均<0.05)；與A組比較，癌及癌旁組織標本中BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白表達均下降(P均<0.05)；A組BRCA1 mRNA與蛋白在癌組織中表達量高于癌旁組織(P均<0.05)，RRCA2 mRNA與蛋白在癌組織及癌旁組織中表達程度無統計學差異(P均>0.05)；B組BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白在癌組織中表達量均低于癌旁組織(P均<0.05)。結論 廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌復發患者癌組織中BRCA1與BRCA2均持續性低表達，二者可能是乳腺癌復發的重要因素。

乳腺癌；乳腺癌易感基因；腫瘤復發；廣西壯族；崇左地區

我國每年女性乳腺癌發病例數達16.9萬，占全球總發病數的12.25%，高居全球第二[1]，是第二位最常見女性惡性腫瘤，亦是女性第六位最常見的惡性腫瘤死亡原因[2]。乳腺癌是臨床較易治療的腫瘤，導致患者死亡的原因是不可控的病情復發，而誘導患者腫瘤細胞再次惡性增殖的機制目前仍不清楚。目前，基因檢測發現乳腺癌組織中有高達289個基因表達改變，涉及39個蛋白功能異常[3]。在遺傳性乳腺癌中，60%～75%是與高外顯性的乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)突變所致[4]。研究發現，中國廣東漢族早發性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2基因異常[5]，而廣西地區散發性乳腺癌患者BRCA異常表達率約為90.0%[6]。但BRCA1和BRCA2在廣西地區壯族早發性乳腺癌患者治愈后復發是否與BRCA1/2異常表達有關，目前尚未見相關報道。2010年3月～2016年3月，我們觀察了廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌復發患者中BRCA1與BRCA2表達變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 廣西醫科大學附屬民族醫院普外科收治的早發性乳腺癌患者30例(A組)，年齡<35歲。腫瘤直徑低于2 cm、組織學分級3級、淋巴結轉移N0期內、組織學類型：浸潤性非特殊癌。早發性乳腺癌復發患者30例(B組)，年齡<35歲。腫瘤直徑低于2 cm、組織學分級3級、淋巴結轉移N0期內、組織學類型：浸潤性非特殊癌。早發性乳腺癌與復發性乳腺癌納入標準參考2015版《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》：①患者年齡均≤35歲；②疾病最終診斷以術中切取病變組織進行病理學檢測結果為準，受試者均為浸潤性非特殊癌；③臨床分期Ⅲb期以下；④早發與復發均在本院治療。乳腺增生患者10例(C組)，年齡<50歲。為排除可疑惡變且經患者同意后，穿刺取病理組織活檢確診的患者。本研究經廣西醫科大學附屬民族醫院人體醫學倫理學委員批準，術前簽署標本處理知情同意書。

1.2 乳腺癌、癌旁及乳腺增生組織中BRCA1、BRCA2 mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。乳腺癌、癌旁及乳腺增生組織術中或診斷穿刺無菌提取后液氮速凍后轉運至-80 ℃冰箱保存。取出腫瘤組織，冰上超聲勻漿機研磨，參照TRIzol法提取總RNA，用ddH2O稀釋1 μL樣品200倍后測定RNA濃度與純度。引物由Primer軟件設計、Takara公司合成，參照反轉錄試劑盒說明，42 ℃反轉錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉錄酶。使用ABI 7300 Real-Time PCR System進行Syber Green 熒光定量PCR檢測，其反應體系為 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL和dH2O 8.5 μL，擴增條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。mRNA采用2-ΔΔCt法進行計算。BRCA2上游引物：5′-CTTGCCCCTTTCGTCTATTTG-3′，下游引物：5′-TACGGCCTGAAGTACAGTCTT-3′，退火溫度60 ℃；BRCA1上游引物：5′-CCCATTTTCCCCCGCAT-3′，下游引物：5′-GGACCTTGGTGGTTTCT3-3′，退火溫度54 ℃；GADPH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，退火溫度64 ℃。

1.3 癌及癌旁組織中BRCA1、BRCA2 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取出凍存標本，采用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIP后置于冰盒進行超聲勻漿，12 000 r/min離心30 min后取上清液，使用BCA標準蛋白測定法測定并記錄各組總蛋白濃度。加上樣緩沖液后沸水浴5 min，取40 μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，在冰水混合液環境中40 V恒壓將蛋白轉至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗后加入BRCA1和BRCA2一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次后加入二抗37 ℃ 2 h。TBST清洗后在Image Lab系統下成像并計算目的條帶灰度值，以GAPDH為上樣量的內參，計算目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值為目的蛋白相對表達量。

2 結果

三組BRCA1、BRCA2 mRNA表達比較見表1,三組BRCA1、BRCA2蛋白表達比較見圖1、表2。與C組比較，A、B組癌組織與癌旁組織中BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA均表達下調(P均<0.05)；與A組比較，B組BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA表達量更低(P均<0.05)；A組BRCA1蛋白及其mRNA在癌組織中表達量顯著低于癌旁組織(P均<0.05)，而BRCA2蛋白及其mRNA則在二者中表達無統計學差異(P均>0.05)；B組BRCA1、BRCA2蛋白及其mRNA在癌組織中表達量低于癌旁組織(P均<0.05)。

3 討論

乳腺癌是最常見的非皮膚癌和婦女癌癥死亡的首要原因[8]。女性乳腺癌發病率在2000年開始下降，但隨著人口老齡化和癌癥風險因素在現代生活方式中的表現恢復到上升趨勢[9]，其重要的原因是乳腺癌復發后病情難以控制，但導致這種復發現狀的機制仍在探究中。BRCA1是一種存在于每個人體內的抑癌基因，其合成的蛋白主要負責修復斷裂DNA，維持基因組穩定性[10]。BRCA1基因失活或故障則是家族性及散發性乳腺癌發病的重要原因，BRCA1突變攜帶者患乳腺癌的風險高達85%[11]。結合本研究中復發患者，推測BRCA1是導致早發性乳腺癌復發的重要因素。研究發現，導致BRCA1基因失活或故障的重要機制之一是基因水平的甲基化修飾[12]，尤其是啟動子的甲基化程度與腫瘤預后生存質量負相關[13]，因此本研究中復發癌組織BRCA1 mRNA表達進一步受到抑制。同時也有研究發現，BRCA1甲基化活性降低的程度與腫瘤分期和大小之間存在相關性[14]，這可能是本研究中復發患者BRCA1蛋白及mRNA水平較初發患者表達量更低的原因。

表1 各組標本中BRCA1 mRNA與BRCA2 mRNA表達比較

注：與C組比較，﹡P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與同組癌組織比較，△P<0.05。

組別nBRCA1蛋白癌組織(增生組織)癌旁組織BRCA2蛋白癌組織(增生組織)癌旁組織C組101．10±0．11-1．31±0．34-A組300．68±0．22﹡0．87±0．26△0．61±0．17﹡0．58±0．07B組300．23±0．02﹡﹟0．14±0．03﹟△0．36±0．06﹡﹟0．14±0．03﹟△

注：與C組比較，﹡P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與癌組織比較，△P<0.05。

BRCA2與BRCA1基因一樣結構上存在差異，但均在乳腺癌和其他組織細胞中表達，在DNA雙鏈斷裂的無差錯修復中起重要作用，當DNA不能修復則破壞細胞[15]。BRCA2發生突變時，則BRCA2基因受到破壞，這種修復DNA的能力喪失則增加患乳腺癌風險[16]。正常狀態下，BRCA2表達于細胞核參與染色體修復，發生惡變時則聚集分布于細胞質中。與BRCA2致病機制不同的是，BRCA1錯位表達于細胞質中，則與核定位信號異常有關[17]。應注意的是，在早發性乳腺癌中，盡管癌組織與癌旁組織中BRCA2均表達下調，但二者比較并無統計學差異。相對于復發癌組織中，BRCA2基因表達增加。這種在早期腫瘤過表達可能反映細胞代償以此提高同源重組修復多余的DNA損傷[18]。在復發性癌組織，BRCA2 mRNA和蛋白水平均低于正常組織，提示BRCA2不可代償的下調導致不可修復的缺損DNA導致癌細胞增加，這為乳腺癌復發的可能機制提供了一個方向。

本研究結果提示，BRCA1蛋白及其mRNA在癌組織中表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義，而BRCA2蛋白及其mRNA則在二者中表達無統計學差異，提示BRCA1轉錄與表達抑制可能是早發性乳腺癌發病的重要因素，且BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA在癌組織中表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義，提示BRCA1和BRCA2均與早發性乳腺癌的復發密切相關。但本研究納入的觀察病例數較少，尚不能完全解釋可能機制。同時研究停留于觀察階段，對病例中BRCA1和BRCA2改變的機制仍需進一步探討。

綜上所述，BRCA1和BRCA2受地域、民族影響，在人群中表達存在一定程度差異。通過比較崇左壯族人群中的早發性乳腺癌和復發性乳腺癌的腫瘤組織和癌旁組織中BRCA1、BRCA2的mRNA、蛋白水平，推測BRCA1和BRCA2低表達不僅是早發性乳腺癌的發病因素，二者持續性降低還是早發性乳腺癌治愈后復發的可能重要原因，此為本地區早發性乳腺癌的防治提供了參考。

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農文偉(E-mail：nwwone@163.com)

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2017-02-20)