噬菌體展示技術在食品安全分析中的應用

趙巖巖,趙圣明,梁 穎,劉賢金,張 浩,李紅波,屠 康(.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003; .江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所,江蘇南京 004; 3.南京農業大學,江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 0095)

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噬菌體展示技術在食品安全分析中的應用

趙巖巖1,趙圣明1,梁 穎2,劉賢金2,張 浩1,李紅波1,屠 康3,*
(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003; 2.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所,江蘇南京 210014; 3.南京農業大學,江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095)

隨著噬菌體展示技術的發展,其在食品安全領域的應用也越來越多,該技術可以作為一種高效的抗體制備技術應用于食品中常見的抗生素、生物毒素、有害小分子的檢測及食源性致病菌控制,同時可以開發有毒待檢物的替代品建立綠色檢測技術。此外,噬菌體展示技術在新型食品防腐劑開發等方面也具有廣闊的應用前景。本文在介紹噬菌體展示技術的基礎上,對其在食品安全領域的應用進行了綜述。

噬菌體展示技術,高通量篩選,食品安全,檢測

噬菌體展示技術是上世紀80年代興起的一種生物學技術,該技術以噬菌體或噬菌粒為載體,將外源多肽或蛋白基因整合到噬菌體基因組中,外源蛋白以融合形式表達并展示在噬菌體表面,可以實現表型和基因型的同步篩選[1-2]。隨著噬菌體技術的不斷發展和完善,噬菌體展示技術迅速成為諸多領域的研究熱點,其在食品安全領域的應用也越來越廣泛。本文在對噬菌體展示技術進行介紹的基礎上,進一步對其在食品安全分析中的應用進行分類綜述,并展望了該技術在食品領域的應用前景,以期為相關學者提供參考。

1 噬菌體展示技術

20世紀80年代,噬菌體展示技術逐步建立并發展起來,該技術系統由改造后的噬菌體、輔助噬菌體和宿主細菌等構成,可以對多基因進行體外克隆、體內克隆和重組表達[3]。噬菌體展示技術可以將抗體表達在重組噬菌體衣殼蛋白的表面,通過對抗原進行多輪親和篩選,分離獲得目的抗體,為抗體的制備提供了新的方法[4-5]。

噬菌體展示技術所展示的片段,可以是天然抗體、免疫抗體、人工合成抗體或多肽,對應的庫分別為天然抗體庫、免疫抗體庫、人工合成抗體庫和肽庫[6]。以未經免疫動物的mRNA為模板,克隆抗體可變區基因,連接到載體上,構建獲得的抗體庫為天然抗體庫。由于天然抗體庫未經免疫,相對免疫庫多樣性更好,不僅局限于對某一種或幾種抗原的識別,能夠對多種抗原進行識別,其應用范圍相對更加廣泛。以免疫動物的雜交瘤細胞或B細胞的mRNA為模板,克隆抗體可變區基因,并將其與載體連接,構建的庫為免疫抗體庫。經抗原免疫后,機體會產生大量的特異性抗體,因此,免疫抗體庫含有大量的特異性抗體基因,可以針對抗原篩選高親和力的抗體。抗原與抗體的特異性結合主要取決于抗體重鏈、輕鏈可變區,通過基因工程手段對抗體可變區基因進行改造,利用這種方法獲得的抗體庫稱為人工合成抗體庫。展示的抗體片段包括Fab、scFv、sDAB和DAB等抗體分子[7],其結構示意圖見圖1。通過化學合成寡核苷酸片段,連接載體,構建的展示庫稱為肽庫,肽庫編碼的肽段可以是從幾肽到數十肽的隨機肽段。

圖1 抗體分子結構[7]Fig.1 Antibody molecule structures[7]

噬菌體展示技術為研究蛋白間的相互作用提供了有利工具,在醫藥、食品、農業檢測等領域得到了廣泛應用[8]。為了滿足各種應用環境的要求和挑戰,噬菌體展示技術也在不斷地改良和更新,目前為止已經構建了M13[3]、λ[9]、T4[10]和T7[11]等噬菌體展示系統。噬菌體展示技術發展歷程如圖2所示。

圖2 噬菌體展示技術發展歷程[12]Fig.2 The development history of the phage display[12]

在抗體篩選上,與傳統的雜交瘤技術相比,噬菌體展示技術的優勢主要表現在:減少或避免實驗動物的使用、抗體生產周期短、成本低、操作相對簡便[13]。此外,篩選的高效率性使得目標蛋白含量在非常低的情況下,通過感染得到富集,使獲得高親和力目標蛋白成為可能;利用噬菌體展示技術篩選獲得的蛋白,可確定其基因型,因此更方便地對其進行基因改造,以期獲得更為理想的蛋白。

噬菌體展示技術將不同DNA編碼的蛋白片段作為噬菌體衣殼蛋白的一部分展示在噬菌體表面,可以實現在大腸桿菌中表達數百萬大庫容的文庫,在對蛋白進行篩選的過程中,同時實現了對基因的篩選,即基因型與表型的統一[14]。展示特異結合位點的噬菌體可以通過多輪結合、洗滌、洗脫和擴增的篩選過程得到富集。篩選示意圖如圖3所示。利用某一靶標對展示庫進行篩選,與該靶標相關的配基會被結合,未結合的噬菌體在洗滌過程中被洗去,結合的噬菌體通過洗脫進行回收,然后擴增富集回收的噬菌粒,經幾輪篩選后,獲得具有高結合活性的噬菌粒,再進一步對其生物學活性進行分析,即可獲得目的配基[15]。

圖3 抗體庫篩選流程圖[16]Fig.3 Selection of antibody by phage display protocol[16]

2 噬菌體展示技術在食品安全領域的應用

自從1985年Smith首次報道噬菌體展示技術以來,噬菌體展示技術迅速的成為諸多領域的研究熱點,其中包括食品安全領域。食品安全長期以來一直是人們關注的焦點問題。隨著噬菌體展示技術的發展,利用噬菌體展示技術篩選食品中有害物質抗體的研究也越來越多,包括在抗生素分析中的應用,生物毒素分析中的應用,農藥小分子檢測中的應用,及食源性致病菌防治中的應用。下面主要對噬菌體展示技術在食品安全這幾個方面的應用展開詳細的介紹。

2.1 在抗生素分析中的應用

由于抗生素的濫用導致食品中抗生素殘留超標已經成為食品安全領域人們愈發關注的焦點。噬菌體展示技術為抗生素免疫檢測中抗體的獲得提供了新思路,近年來已通過噬菌體展示技術篩選獲得了多種抗生素的抗體。Burmester等[17]利用免疫小鼠構建的單鏈抗體庫,篩選獲得與氨芐西林具有良好識別活性的單鏈抗體,并對其晶體結構、結合位點進行了分析研究。Xiao等[18]利用構建的免疫單鏈抗體庫,篩選伊維菌素單鏈抗體,最終獲得10個與伊維菌素具有良好結合活性的克隆。Nejad[19]利用莫能菌素作為半抗原免疫小鼠構建免疫單鏈抗體庫,篩選獲得能夠識別莫能菌素的單鏈抗體,并建立了熒光偏振免疫分析方法。孟輝等[20]以免疫獲得的雜交瘤細胞株為基因來源構建噬菌體展示單鏈抗體庫,經篩選后獲得9個與慶大霉素具有結合活性的單鏈抗體。上述噬菌體展示抗體的開發,使抗體的大量制備變得簡單易行,所獲得的抗體在今后的改造過程當中也更容易操作,為免疫檢測技術在抗生素檢測中的發展奠定了良好的基礎。

2.2 在生物毒素分析中的應用

生物毒素包括細菌毒素、真菌毒素、植物毒素、動物毒素、海洋生物毒素等,常常污染食品和飼料,對人畜造成了極大的危害。因此對食品和飼料中生物毒素進行監測非常必要。基于噬菌體展示技術發展起來的檢測方法已有很多,同時噬菌體展示技術的發展使毒素的無毒抗原制備成為可能。Nagumo等[21]利用磁珠篩選法對噬菌體抗體庫進行篩選,獲得識別魚肉毒素的抗體。Zhao等[22]利用噬菌體展示技術篩選獲得了能識別微囊藻毒素的多肽。Iain等[23]利用自己構建的軟骨藻酸羊免疫抗體庫,基于篩選獲得的抗體建立了檢測軟骨藻酸的競爭ELISA方法。Doyle等[24]利用免疫羊駝構建的乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單域抗體庫,篩選獲得其單域抗體,并建立了競爭ELISA檢測分析方法和熒光偏振免疫分析方法。Houwelingen等[25]利用噬菌體展示庫篩選獲得赭曲霉毒素的納米抗體,建立了競爭ELISA檢測方法。Wang等[26]利用噬菌體展示隨機8肽庫篩選獲得能夠模擬黃曲霉毒素表位的多肽,并建立了綠色ELISA檢測方法。Xue等[27]制備黃曲霉細胞壁免疫雞,構建雞源單鏈抗體庫,從中篩選出高親和力的單鏈抗體,與堿性磷酸酶融合表達后建立高靈敏度的黃曲霉檢測方法。Qiu等[28]利用納米抗體庫和嘔吐毒素的單克隆抗體進行篩選,獲得兩個與嘔吐毒素單克隆抗體具有結合活性的納米抗體,可以替代嘔吐毒素作為包被抗原應用到免疫檢測中,同時對模擬抗原的分子機制進行了研究。Hu等[29]對親和力成熟的單鏈抗體庫進行篩選,獲得識別伏馬菌素的單鏈抗體,并用于伏馬菌素的免疫檢測。Xu等[30]利用噬菌體單域抗體庫篩選獲得桔霉素的抗獨特型抗體,并應用于桔霉素的檢測中。Wang等[31]篩選獲得了玉米烯醇的抗獨特型抗體,并建立了免疫PCR檢測方法,用于谷物中玉米烯醇的檢測。同時一些毒素的抑制劑也被發現,Gupta等[32]利用噬菌體展示技術篩選獲得能夠中和大腸桿菌內毒素的單域抗體。上述抗體的制備為生物毒素的檢測提供了有效的檢測方法;一些抗獨特型抗體可以替代有毒抗原的使用,建立了綠色免疫檢測新技術,降低了檢測過程中有毒抗原給檢測人員及環境造成的危害。

2.3 在食品中有害小分子檢測中的應用

自噬菌體展示技術出現以來,已篩選獲得多種農藥小分子的抗體和抗獨特型抗體[33],為小分子的免疫檢測提供了新材料。與此同時,建立食品中多殘留免疫檢測方法,用于農藥的快速篩查已經成為目前一個熱門研究方向,噬菌體展示技術的發展為其提供了有力的工具。Tiejun等[34]通過免疫小鼠并構建甲胺磷免疫噬菌體展示抗體庫,從中篩選獲得與甲胺磷具有良好結合活性的抗體,并建立甲胺磷競爭ELISA檢測方法。Brichta等[35]采用固相篩選法利用2,4-二氯苯氧乙酸除草劑對未經免疫的抗體庫進行篩選,獲得具有結合活性的抗體,并建立了間接競爭ELISA檢測方法。Yi等[36]利用丙酸、阿特拉津、西瑪津、異丙隆衍生物作為半抗原混合免疫家兔,構建噬菌體單鏈抗體庫,篩選出與半抗原具有結合活性的單鏈抗體。González-Techera等[37]利用噬菌體展示的免疫復合物多肽,構建了檢測草脫凈電化學免疫傳感器。Liu等[38]利用7肽庫篩選獲得識別吡蟲啉的多肽,建立了競爭ELISA檢測方法,并對水樣和土樣中吡蟲啉進行了檢測。Hua等[39]基于噬菌體展示肽庫篩選獲得的多肽,建立了有機磷農藥多殘留檢測方法。小分子農藥對人體和環境也存在著一定的毒性,其抗獨特型抗體在免疫檢測中可以替代抗原,開發無毒免疫檢測技術。實踐生產環節中需要此類快速篩查技術對果蔬中的農藥殘留進行初步檢測,保證人們能夠享受新鮮果蔬,同時也確保了食品的安全性。除了檢測農藥小分子外,噬菌體展示技術還被用于食品添加劑的檢測。Lee等[40]研究對12肽庫進行5輪篩選后,獲得能夠識別苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的多肽,并有望應用于檢測。

2.4 在食源性致病菌控制中的應用

目前利用噬菌體展示技術,篩選肽或蛋白用于食源性致病菌防治的研究已有報道。在實際應用中這些多肽或蛋白可能出現穩定性差、易降解等問題,利用其易于改造的特點,Pini等[41]利用十肽庫對大腸桿菌進行篩選,獲得具有抑菌活性的多肽,并將其改造成對肽酶和蛋白酶穩定、抑菌活性顯著提高的抗菌肽。Bishop-Hurley等[42]利用噬菌體展示肽庫篩選獲得11個與空腸彎曲桿菌具有結合活性并能抑制其生長的多肽。Sainath等[43]利用噬菌體展示隨機肽庫篩選獲得識別大腸桿菌表面的多肽,獲得的多肽對革蘭氏陰性菌具有抑菌活性,對大腸桿菌和綠膿桿菌具有良好的抑菌活性。鑒于上述新型抗菌物質的發現,通過噬菌體展示技術篩選獲得抑菌蛋白替代傳統的化學防腐劑在食品防腐保鮮領域將具有廣闊的市場應用前景。Agrawal等[44]篩選肽庫獲得可以用于鼠傷寒沙門氏菌檢測的多肽,可以用于檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌污染的程度。在食品安全備受人們關注的大環境下,相信該技術也將能夠被更廣泛地應用于食源性致病菌的預防和控制中。

3 前景與展望

我國是農業大國,抗生素、農藥的使用,食品中微生物及其毒素的污染,給食品安全帶來了潛在的威脅。食品中有害成分的檢測及致病微生物的控制已經成為當前食品安全領域的研究熱點,近年來基于噬菌體展示技術發展起來的高通量篩選技術在食品安全領域得到了廣泛的應用。在篩選特異性的噬菌體、抗體、多肽等時,噬菌體展示篩選庫容量大、周期短、操作簡單成本低等優勢[45]。在對食品中有毒有害物質進行檢測時,可以利用噬菌體展示技術篩選其模擬抗原,進一步結合相關免疫學檢測技術,建立綠色、安全的檢測方法,以期減少對人體和環境所造成的危害。利用噬菌體展示技術篩選獲得具有抑菌活性的多肽可以用于食品中微生物污染的控制。在食品安全領域快速發展的大背景下,噬菌體展示技術也會得到飛速發展,其優勢也將得到更充分的應用。抗獨特型抗體具有模擬抗原活性的潛能,今后對噬菌體展示技術的研究,可以從篩選獲得農藥的抗獨特型抗體開展,篩選具有農藥功效的綠色替代品,減少農藥的使用,從根源上減少農藥對食品造成的污染;還可以將噬菌體展示技術與其他先進技術如膠體金技術結合使用,兩者的結合使其在應用中更加快速、便捷;也可以將食源性致病菌的蛋白質組以噬菌體展示的形式表達,可以用于藥物靶標的篩選,用于分析藥物與微生物的相互作用,為食源性致病菌的防治提供新思路。

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Application of phage display technology in food safety

ZHAO Yan-yan1,ZHAO Sheng-ming1,LIANG Ying2,LIU Xian-jin2,ZHANG Hao1,LI Hong-bo1,TU Kang3,*

(1.Department of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.Ministry of Agriculture Institute of Food Quality Safety and Detection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China; 3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In this article,the phage display technology was described,and its application in food safety was summarized. With the development of the phage display technology,it is widely used in the food safety. It can be used as an efficient method of generation of antibody to detect antibiotic,bio-toxin and small molecule in food,used to screening mimic for developing green detection technology,and the control of foodborne pathogenic bacterial. In addition,this technology also showed broad application in the field of developing novel food preservatives.

phage display technology;high throughput screening;food safety;detection

2016-12-20

趙巖巖(1987-)，女，博士，講師，研究方向：微生物與生物技術，E-mail：zhaoyanyan@hist.edu.cn。

*通訊作者:屠康(1968-)，男，博士，教授，研究方向：農產品無損檢測、農產品貯藏與加工，E-mail：kangtu@njau.edu.cn。

河南省高校科技創新團隊支持計劃(16IRTSTHN007)；河南省科技攻關項目(162102110065，172102310240)；河南科技學院高層次人才科研項目(2016019)。

TS201

A

1002-0306(2017)14-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.067