超聲輔助提取黑果枸杞花色苷的工藝優化

鄭 覃,李建穎,楊 璐,王青霞,王 佳,李孟璇(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

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超聲輔助提取黑果枸杞花色苷的工藝優化

鄭 覃,李建穎*,楊 璐,王青霞,王 佳,李孟璇
(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

利用響應面分析法對黑果枸杞花色苷的超聲輔助提取工藝進行優化。以總花色苷含量為指標,選取液料比、超聲提取溫度、超聲提取時間和乙醇濃度為主要因素進行單因素實驗,并通過響應面分析法進行四因素三水平的Box-Behnken實驗,對提取條件進行優化。結果表明:液料比20.4∶1 mL/g,超聲提取溫度48 ℃,超聲提取時間24.8 min,乙醇濃度79%為最佳提取條件,該條件下花色苷提取量可達(14.999±0.014)mg/g。各因素對花色苷提取量的影響程度依次為:超聲提取溫度>乙醇濃度>超聲提取時間>液料比。

黑果枸杞,響應面分析,提取,花色苷,工藝優化

黑果枸杞為茄科枸杞屬的植物,其果微甜,性平,清熱,擁有很好的藥用和食用價值。黑枸杞中富含豐富的花色苷類成分[1],是一種天然的抗氧化劑[2],抗氧化活性遠強于維生素C、維生素E等[3-4],其結構上含有的眾多酚羥基能夠阻斷自由基鏈式反應,從而有效清除活性氧簇(ROS)[5-6]。

花色苷的提取受多種因素的影響,主要因素有原料比表面積、提取溶劑的種類、濃度、液料比、pH、提取溫度、時間以及提取次數等[7]。目前,花色苷的提取方法有水提取、有機溶劑提取、超臨界流體萃取、超聲波提取和酶解輔助提取等方法[8],普遍存在提取率低、有機溶劑易污染環境等缺點。根據提取花色苷目的的不同,可選取不同的溶劑進行提取實驗。例如,若是為了對提取的花色苷進行定性定量分析,常選取三氟乙酸甲醇溶液，因為采用此種溶液提取不會破壞花色苷類物質的結構,且不易將大分子的蛋白質、糖類帶入;若是為了將提取的花色苷用于食品添加,則常采用酸性乙醇溶液，因為此法可保持最大色素得率,保持色素穩定性及提取物安全[9]。研究表明,花色苷類物質本身結構不穩定,光照、溫度、pH等理化性質都會影響其結構的穩定性;提取時應避免光照,溫度不宜太高,提取時間也不宜過長,避免花色苷類成分發生降解[10-13]。同時,溶劑提取法雖然操作相對簡單,對設備要求較低,但是也存在提取效率低,雜質含量高,提取時間較長與熱不穩定等缺點,故實際操作時,常采用超聲、震蕩或微波等輔助提取[14-16]。本實驗將超聲波提取法與有機溶劑提取法相結合,研究不同因素條件下對黑果枸杞花色苷提取的影響,通過響應面優化實驗確定最佳工藝條件,為黑果枸杞花色苷的綜合開發與利用提供理論及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞干果 甘肅省民勤縣購買;乙醇 分析純，天津市凱通化學試劑有限公司;鹽酸 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司;冰乙醇 分析純，天津大學科威公司;醋酸鈉 分析純，天津市德恩化學試劑有限公司;氯化鉀 分析純，天津光復科技發展有限公司;錦葵色素-3-葡萄糖苷標準品 上海華藍化學科技有限公司。

DK-8AS電熱恒溫水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司;AUY220電子分析天平 日本島津公司;RV10DIGITAL旋轉蒸發儀 德國IKA;UV-2600紫外可見分光光度計 日本島津公司;XO-SM50超聲波微波協同反應系統 南京先歐儀器制造有限公司;DH-101電熱鼓風干燥箱 上海精密科學儀器有限公司;LWF6-BI低溫粉碎機 福建莆田電宏強有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科技工貿有限有限公司;Bante210 pH計 上海般特儀器有限公司;SW-CJ-1FB超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將黑果枸杞置于35 ℃恒溫條件下,烘干至恒重,粉碎,過60目篩,即得黑果枸杞干粉[17]。

1.2.2 總花色苷提取工藝 準確稱取2.000 g黑果枸杞干粉,置于100 mL圓底燒瓶中;加入1%鹽酸酸化乙醇(體積比1∶99),避光恒溫超聲輔助提取(超聲頻率40 kHz);4000 r/min離心5 min收集上清液;酸性乙醇定容至100 mL,即得提取液。

1.2.3 總花色苷含量測定 采用pH試差法測定總花色苷的含量[18-20],以錦葵色素-3-葡萄糖苷為計量標準,測定總花色苷的含量[21]。

將得到的提取液分別用pH1.0(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67,v/v)和pH4.5(0.2 mol/L NaAc·3H2O:0.2 mol/L HAc=1∶1,v/v)緩沖液稀釋10倍,混合均勻后,放入恒溫水浴鍋中平衡30 min,作為實驗組。采用1%酸性乙醇代替提取液,同樣條件下處理,平衡30 min,作為空白組。待平衡結束后,分別測其在530 nm和700 nm下的吸光度。按下式計算總花色苷含量[22-23]:

花色苷含量(mg/g)=[(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5×Mw×DF×V]/ε×L×m

式中:Mw-錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量,493200 mg/mol;DF-稀釋因子;V-提取液的體積,0.1 L;ε-摩爾消光系數,29600 L/(mol·cm);L-光程厘米數,1 cm;m-原料的質量,2.000 g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,分別在30、40、50、60、70 ℃的水浴中提取黑果枸杞花色苷,液料比為20∶1 mL/g,提取25 min。

1.2.4.2 超聲提取時間對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,提取液料比為20∶1 mL/g,設定不同的提取時間(15、20、25、30、35 min)提取黑果枸杞花色苷。

1.2.4.3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,設定不同濃度(50%、60%、70%、80%、90%)的酸化乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,提取液料比為20∶1 mL/g,提取黑果枸杞花色苷,提取25 min。

1.2.4.4 液料比對花色苷提取效果的影響 采用超聲波輔助的方法,以酸化的80%乙醇為提取溶劑,提取溫度50 ℃,設定不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)提取黑果枸杞花色苷,提取25 min。

1.2.5 響應面優化實驗 根據響應面實驗設計原理,綜合單因素實驗的結果,選擇超聲提取時間、超聲提取溫度、乙醇濃度和液料比四個因素,以黑果枸杞中花色苷含量為響應值,設計響應面實驗[24-26]。因素水平見表1。

表1 實驗因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.6 數據處理 本文在單因素實驗分析的基礎上,采用Box-Benhnken設計方案,借助Design-Expert 8.0軟件并結合方差分析法,得出最優的黑果枸杞花色苷的提取條件。

2 結果與分析

2.1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響

超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響如圖1所示。由圖1可見,隨著溫度的升高,花色苷的含量也在逐漸上升。由分子運動論可知,溫度升高會使分子運動加快,溶解和擴散的速度也隨之加快,溫度較高可能會使細胞膜結構發生變化,更易使花色苷被釋放到溶劑中,從而使其花色苷的含量逐漸上升[27]。但溫度到達50 ℃以后,花色苷的提取效果明顯下降，是由于溫度過高使部分花色苷的結構遭到破壞,最終使得提取效果降低,所以50 ℃為最佳超聲提取溫度。

圖1 超聲提取溫度對花色苷提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the anthocyanins extraction

2.2 超聲提取時間對花色苷提取效果的影響

超聲提取時間對黑果枸杞花色苷提取的影響如圖2所示。由圖2可見,隨著超聲提取時間的延長,花色苷的含量逐漸增加。但當時間超過25 min后,花色苷的含量呈明顯下降的趨勢,一方面是由于超聲時間過長,氧化或光照反應會導致花色苷發生分解,使其含量降低;另一方面是由于超聲提取時間過長導致其他非花色苷成分大量溶出,從而使得提取率降低。所以最佳超聲提取時間為25 min。

圖2 超聲提取時間對花色苷提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the anthocyanins extraction

2.3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響

乙醇濃度對黑果枸杞花色苷提取的影響如圖3所示。由圖3可知,隨著乙醇濃度的不斷增高,黑果枸杞提取物中的花色苷的含量逐漸上升,說明在一定范圍內,隨著乙醇濃度的增加,溶劑的滲透力也隨之增加,從而有利于花色苷的溶出,但當乙醇濃度過高時,溶液的極性降低不利于弱極性的花色苷的溶出。所以80%的乙醇為最佳提取溶劑。

圖3 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the anthocyanins extraction

2.4 液料比對花色苷提取效果的影響

液料比對黑果枸杞提取效果的影響如圖4所示。由圖4可以看出,隨著液料比的逐漸增加,花色苷的質量分數先上升后下降,原因是溶劑在一定范圍內能充分提取花色苷,若進一步增加液料比,花色苷不再溶出，而其他成分溶出，會使花色苷的濃度降低,且成本會增大,所以最佳液料比為20∶1 mL/g。

圖4 液料比對花色苷提取效果的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the anthocyanins extraction

2.5 響應面優化花色苷提取條件

2.5.1 響應面實驗結果 綜合單因素實驗結果,根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,以花色苷含量Y為響應值,利用Design-Expert軟件設計四因素三水平的響應面實驗,實驗結果如表2所示。

表2 響應面實驗結果Table 2 Result of response surface test

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:**表示在0.01水平顯著;* 表示在0.05水平顯著。

2.5.2 方差分析 使用Design-Expert 8.0軟件對29個實驗點的響應值進行方差分析,由于交互項C×D極不顯著,因此采用手動優化的方法對得到的回歸模型進一步優化,分析結果見表3。

經回歸擬合后,得到黑果枸杞花色苷提取率對各實驗因子的二次多項回歸方程為:

Y=14.99+0.021A-0.15B-0.025C-0.075D+0.022AB+0.028AC-0.035AD+0.067BC-0.12BD-0.24A2-0.32B2-0.39C2-0.28D2

該方程中各項系數絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度,系數的正、負反映了影響的方向。由于該方程的二次項系數均為負值,可以推斷方程代表的拋物面開口向下,因而具有極大值點,可以進行優化分析。由方程的一次項系數可以得出,影響黑果枸杞花色苷提取率因素的主次順序為:B(提取溫度)>D(乙醇濃度)>C(提取時間)>A(液料比)。

由表3可知,整個回歸模型極顯著(p<0.0001),說明模型是有意義的;校正R2=0.9488說明該模型能解釋94.88%響應值的變化;失擬項不顯著(p>0.05),表明模型與實際情況擬合較好,使用該方程代替真實的實驗點進行分析是可行的。一次項B、D顯著,A、C不顯著,BC、BD交互項影響顯著,其他交互項影響不顯著,二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著。

2.5.3 交互作用分析 為進一步研究因素間的交互作用,通過Design-Expert繪制響應曲面圖進行直觀分析,結果見圖5、圖6。

圖5 溫度與乙醇濃度對花色苷含量的交互作用Fig.5 Effect of interaction between temperatureand ethanol concentrationon the anthocyanin content

圖6 溫度與時間對花色苷含量的交互作用Fig.6 Effect of interaction between temperature and time on the anthocyanin content

由圖5可知:在一定范圍內,花色苷含量隨提取溫度及提取劑的濃度的增大都是先增加后降低,這一點與單因素實驗時整體趨勢相符;通過方差分析可知,提取溫度與乙醇濃度交互項對提取的花色苷含量影響顯著(p<0.05)。由圖6可知:在一定范圍內,隨著提取溫度的增大,提取的花色苷的含量平緩增加,到達一定值后,隨著提取溫度的增大而迅速降低;隨著提取時間的增加,提取的花色苷的含量先增加后降低,整體趨勢與單因素實驗時基本相符;由方差分析結果可知,提取溫度與提取時間交互項對提取的花色苷含量影響顯著(p<0.05)。

2.5.4 最佳提取工藝的預測及驗證 對優化后的回歸方程求解,在實驗范圍內提取花色苷的最佳工藝條件為:液料比20.37∶1 mL/g,提取溫度47.77 ℃,提取時間24.75 min,乙醇濃度79.08%,此條件下提取的花色苷含量理論上可達15.01 mg/g。考慮到實際實驗條件,將其校正為液料比20.4∶1 mL/g,提取溫度48 ℃,提取時間24.8 min,乙醇濃度79%,在此條件下進行三組平行實驗,提取得到的花色苷的含量為(14.999±0.014)mg/g,結果與預測值基本相符,證明了該模型的有效性。

3 結論與討論

超聲輔助提取黑果枸杞花色苷的過程中,各因素對花色苷提取效果的影響大小依次為提取溫度>乙醇濃度>提取時間>液料比。采用響應面法優化提取工藝,經驗證實驗,最終確定最佳工藝條件為20.4∶1 mL/g,提取溫度48 ℃,提取時間24.8 min,乙醇濃度79%,此條件下提取得到的黑果枸杞花色苷含量為(14.999±0.014)mg/g。與潘自皓[5]等采用靜置法,提取溶劑1%甲酸,提取溫度75 ℃,料液比30∶1 mL/g,每次提取時間1 h和提取次數3次,提取得到黑果枸杞花色苷含量為(4.51±0.06)mg/g相比,采用超聲輔助酸性乙醇作提取劑提取黑果枸杞花色苷,極大程度上節約了時間,且提取率明顯提高。

[1]李進,趙紅艷,原惠,等. 黑果枸杞色素性質研究[J]. 食品科學,2006,27(10):146-151.

[2]何如喜. 超聲波輔助提取野生黑果枸杞花青素工藝研究[J]. 青海師范大學學報:自然科學版,2015,31(1):49-55.

[3]Araceli C,Madelourdes P H,Maelena P,et al. Chemical studies of anthocyanins:A review[J]. Food Chemistry,2009,113(4):859-871.

[4]Lee J H,Lee H J,Choung M G. Anthocyanin compositions and biological activities from the red petals of Korean edible rose(Rosahybridacv. Noblered)[J].Food Chemistry,2011,129(2):272-278.

[5]潘自皓,顧子楊,周帥,等. 黑枸杞花色苷提取工藝的優化[J]. 食品工業科技,2016,37(16).

[6]Rice-Evans C A,Miller N J. Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food[J]. Biochemical Society Transactions,1996,24(3):790-795.

[7]Cissé M,Bohuon P,Sambe F,et al. Aqueous extraction of anthocyanins from Hibiscus sabdariffa:Experimental kinetics and modeling[J]. Journal of Food Engineering,2012,109(1):16-21.

[8]馬養民,逯文靜. 藍莓果中花青素的乙醇提取工藝研究[J]. 安徽農業科學,2011,39(35):21768-21769.

[9]米佳,閆亞美,曹有龍,等. 花色苷類物質的提取、分離、鑒定[J]. 寧夏農林科技,2016,57(1):40-47.

[10]趙立儀,李路寧,申芮萌,等. 酰基化藍莓花青素的穩定性研究[J]. 食品工業科技,2014,35(22):299-303.

[11]Maran J P,Sivakumar V,Thirugnanasambandham K,et al. Extraction of natural anthocyanin and colors from pulp of jamun fruit[J]. Journal of Food Science and Technology,2014,52(6):1-10.

[12]Chandrasekhar J,Madhusudhan M C,Raghavarao K. Extraction of anthocyanins from red cabbage and purification using adsorption[J]. Food and Bioproducts Processing,2012,90(4):615-623.

[13]Anuar N,Mohd Adnan A F,Saat N,et al. Optimization of extraction parameters by using response surface methodology,purification,and identification of anthocyanin pigments in Melastomamalabathricum fruit[J].The Scientific World Journal,2013:1-10.

[14]張元德,白紅進,殷生虎,等. 黑果枸杞花色苷色素微波輔助提取的優化[J]. 新疆農業科學,2010,47(7):1293-1298.

[15]時玉晴,蘇東民,蘇東海,等. 超聲波輔助法提取黑色小麥麩皮花色苷工藝優化[J]. 糧食與油脂,2015(4):15-18.

[16]陳亮,張煒,陳元濤,等. 響應曲面法優化黑果枸杞多糖的超聲提取工藝[J]. 食品科技,2015(1):220-227.

[17]孫婧超,劉玉田,趙玉平,等. pH示差法測定藍莓酒中花色苷條件的優化[J]. 中國釀造,2011(11):171-174.

[18]王少波,杜永峰,姚秉華. pH示差法測定黑豆皮中的花青素[J]. 化學分析計量,2008,17(1):46-47.

[19]張玲艷,王宏權. 黑枸杞花青素的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業,2014(12):88-91.

[20]張文君,宋春曉,張國鋒,等. 山楸梅漿果中花青素提取方法的優化和測定[J]. 中成藥,2016,38(8):1856-1858.

[21]譚亮,董琦,曹靜亞,等. 黑果枸杞中花色苷的提取與結構鑒定[J]. 天然產物研究與開發,2014(11):1797-1802.

[22]涂宗財,尹月斌,姜穎,等. 超聲波輔助提取玫瑰茄花青素的工藝優化[J]. 食品研究與開發,2011,32(10):1-4.

[23]師文添,扶慶權. 玫瑰茄中花青素的超聲波提取工藝研究[J]. 食品研究與開發,2010,31(12):86-89.

[24]呂春茂,王新現,董文軒,等. 響應面法優化越橘花色苷微波輔助提取工藝參數[J]. 食品科學,2011,32(6):71-75.

[25]劉青梅,高娟,姜敏芳,等. 響應面法優化楊梅渣中花色苷提取工藝[J]. 中國食品學報,2014,14(6):90-96.

[26]吐爾遜,王選東,李婷. 黑果枸杞色素的提取工藝研究[J]. 安徽農業科學,2007(4):1111-1112.

[27]張艷臻. 物質的分子運動論和溫度[J]. 物理通報,1996(4):8-13.

Process optimization for ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins fromLyciumruthenicumMurray

ZHENG Tan,LI Jian-ying*,YANG Lu,WANG Qing-xia,WANG Jia,LI Meng-xuan

(College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,Tianjin 300134,China)

The ultrasonic-assisted extraction process of anthocyanins fromLyciumruthenicumMurray was optimized by response surface methodology in this paper. Total anthocyanins content as index,the liquid to solid ratio,extraction temperature,extraction time and ethanol concentration were selected as the main factors through the single factor experiment. Thus the Box-Behnken experimental design was carried out with four factors and three levels and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions.The results indicated that the optimal extraction conditions were determined as follows:the liquid to solid ratio of 20.4∶1 (mL/g),extraction temperature of 48 ℃,extraction time of 24.8 min and ethanol concentration of 79%. Under the above conditions,the extraction content of anthocyanins could reach(14.999±0.014)mg/g. The primary and secondary order of the factors affecting the extraction content of anthocyanins was extraction temperature,alcohol concentration,extraction time,and liquid to solid ratio.

LyciumruthenicumMurray;response surface methodology;extraction;anthocyanins;process optimization

2016-11-30

鄭覃(1994-)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail:m18222069272_1@163.com。

*通訊作者:李建穎(1961-)，女，碩士，教授，研究方向：天然產物的提取、分離與純化，E-mail:ljying@tjcu.edu.cn。

天津商業大學科技成果轉化獎勵項目(60207-2015CGZH0202)；國家級大學生創新訓練計劃項目(201510069047)；天津市大學生創業實踐計劃項目(201610069044)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)14-0227-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.044