紅棗白蘭地發酵過程中酒醅氨基酸和有機酸的變化分析

嚴 超,侯麗娟,齊曉茹,趙 歡,王 頡(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

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紅棗白蘭地發酵過程中酒醅氨基酸和有機酸的變化分析

嚴 超,侯麗娟,齊曉茹,趙 歡,王 頡*
(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

利用高效液相色譜法(HPLC)對紅棗白蘭地酒醅發酵過程中的氨基酸和有機酸含量,及發酵過程中酒度、酸度的動態變化進行了分析研究。研究表明:紅棗白蘭地發酵酒醅中檢測到16種氨基酸和7種有機酸,其中脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸是紅棗白蘭地發酵的主要氨基酸,發酵過程中平均含量分別為39.749、35.477、11.888 mg/g;乙酸、蘋果酸、乳酸是紅棗白蘭地發酵的主要有機酸,在發酵結束時含量分別為8.189、4.243、3.646 mg/g。發酵過程中,氨基酸和有機酸整體含量呈增長趨勢;甜味氨基酸和鮮味氨基酸為總氨基酸含量的45.39%、35.79%,苦味氨基酸含量較低,酒醅中氨基酸是紅棗白蘭地中風味成分的重要前體物質,并賦予紅棗白蘭地柔和的風味;比例協調的有機酸有利于增強酒的醇厚口感。

紅棗白蘭地,酒醅,氨基酸,有機酸,動態變化

棗為鼠李科棗屬植物—棗樹的成熟果實,我國紅棗產量占世界總產量的90%以上[1]。以紅棗為原料發酵、蒸餾而成的紅棗白蘭地棗香濃郁,風味獨特,且保留了紅棗的營養價值及藥用價值[2]。紅棗白蘭地作為一種功能性蒸餾酒,在我國已有小規模的生產[3]。

紅棗白蘭地發酵過程與酒醅微生物生長代謝密切相關,在發酵過程中,微生物此消彼長,通過代謝作用產生醇、酸、酯等香氣物質,賦予了紅棗白蘭地特殊的風味物質。其中氨基酸和有機酸是紅棗白蘭地重要的呈味物質,它們作為酒體風味的前體物質直接影響酒的口感品質。氨基酸本身就呈現豐富的味道[4],如絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、脯氨酸、組氨酸呈甜味;天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸呈鮮味;精氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸呈苦味;半胱氨酸、苯丙氨酸呈芳香味[5-6]。這些氨基酸除了為酒體提供直接的感官特征、參與風味物質的代謝外，還與酒中醇、酯、酮等協同作用構成紅棗白蘭地特有的風味物質。氨基酸是酵母賴以生存的氮源之一,尤其是谷氨酸、天冬氨酸,氮元素缺乏會導致酒精發酵遲緩[7];而缺乏α-氨基酸不能實現轉氨作用,會使糖類代謝合成酮酸,脫酸還原成高級醇,高級醇的含量直接影響酒體風味[8]。褚小米等[9]對黃酒發酵過程中糖類和氨基酸的代謝途徑進行了研究和分析;白衛東等[10]研究了不同紅曲對廣東客家黃酒發酵過程中氨基酸含量的影響,研究發現復配釀制的黃酒中氨基酸總量、氨基酸風味和必需氨基酸含量明顯優于單用紅曲釀制的黃酒;田園等[11]研究了赤霞珠干紅葡萄酒發酵過程中氨基酸的轉化及利用。商敬敏等[12]對桑葚酒發酵過程中的有機酸含量變化進行了研究,對比了果汁發酵前后有機酸的變化;曹云剛等[13]采用氣相色譜質譜對汾酒酒醅發酵過程中的有機酸進行測定,結果表明酒醅中乳酸含量最高,乙酸次之,且含量隨發酵進行呈整體上升趨勢。牟穰[14]研究了清爽型黃酒不同發酵時期有機酸和氨基酸的變化情況,并與微生物進行相關性分析。

本實驗首次以紅棗白蘭地為對象,研究發酵過程中酒醅氨基酸和有機酸風味物質的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 市售阜平紅棗;稻殼 保定市槐茂有限公司;釀酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;濃鹽酸、乙酸鈉、三乙胺、冰醋酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸、磷酸氫二銨 天津市天力化學試劑有限公司(分析純);乙腈 MREDA TECHNOLOGY INC(色譜純);2,4-二硝基氯苯 山東西亞化學試劑有限公司(分析純);氨基酸標準品(天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、牛磺酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)、有機酸標準品(草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸) 上海源葉生物科技有限公司(色譜純)。

Waters Breeze高效液相色譜儀(含2489紫外檢測器、自動進樣器和CLASS-VP工作站);HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司;AR423CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;CP214分析天平 上海菁海儀器有限公司;SPX型生化培養箱 寧波東南儀器有限公司;SK5200H超聲儀 上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 原料→剪碎→浸泡12 h→加入稻殼→ 蒸煮處理→酵母活化接種→發酵→蒸餾。

原料:挑選無病蟲害的紅棗清洗、瀝干,去棗核,將棗肉剪碎,加水室溫浸泡12 h,添加稻殼,發酵原料中棗、水、稻殼比例為6∶6∶1。

熱處理:將攪拌混勻的原料于密閉容器中進行100 ℃蒸汽加熱30 min。

活化:將紅棗質量1.5‰的安琪酵母加入30 mL 2%的葡萄糖溶液中溶解,先置于45 ℃水浴鍋中活化15 min,之后置于30 ℃水浴鍋中活化1 h。

發酵:接入酵母后,于(30±1) ℃培養箱中發酵5 d。從開始發酵,每隔12 h,取酒醅進行測樣。

蒸餾:取200 g發酵結束后的原料放于蒸餾燒瓶中,添加300 mL去離子水,蒸餾,收集餾出液,得到紅棗蒸餾酒。

1.2.2 氨基酸測定

1.2.2.1 溶液配制 緩沖鹽溶液:0.53 g Na2CO3和0.42 g NaHCO3分別溶于10 mL水中,取700 μL Na2CO3溶液加入到10 mL NaHCO3溶液中;衍生劑:0.3 g 2,4-二硝基氯苯溶于1 mL乙腈中。

1.2.2.2 樣品前處理 取3 g酒醅加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液,放入烘箱110 ℃下水解20 h。水解完全后,取上清液1 mL于試管中,在90 ℃下用真空泵抽干。再用2 mL 0.1 mol/L的HCl溶液回溶,渦旋混合過無機膜,放入小離心管中待衍生。取100 μL待衍生樣品,加入200 μL緩沖鹽溶液,100 μL衍生劑,在90 ℃恒溫水浴鍋內衍生90 min。加入50 μL 10%乙酸溶液,加水定容至1 mL,混勻,排氣泡,取上清液用0.22 μm有機膜過濾,待測。氨基酸混標進行衍生同樣品,待測[15]。

1.2.2.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm);流動相A:純乙腈;流動相B:2.5 g乙酸鈉、1.5 mL三乙胺、1.17 mL冰乙酸溶于1 L水中,抽濾過膜,超聲;洗脫程序:T(min)/B(%):0/82、10/82、15/80、30/55、35/55、38/45、42/40、45/82;檢測波長:360 nm,參比波長400 nm;柱溫:40 ℃;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL。

1.2.3 有機酸測定

1.2.3.1 樣品前處理 取15 g酒醅,用50 mL純凈水浸出其可溶性成分30 min,減壓抽濾,10000 r/min離心10 min。取濾液5 mL,加入0.2 mL 1 mol/L磷酸溶液,純凈水定容至10 mL,0.22 μm濾膜過濾,待測[16]。

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil Plus C18-A(5 μm×4.6 mm×250 mm);流動相:0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液,用磷酸調pH至2.7;檢測波長:210 nm;柱溫:30 ℃;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL[17]。

1.3 酒精度測定

蒸餾-酒精計法[18]。

1.4 酸度測定

酸度:100 g酒醅消耗1 mmol NaOH為一度酸度。采用酸堿滴定法[19]。

1.5 數據處理

實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析,差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 紅棗白蘭地發酵過程中酒精度的變化

對發酵過程中紅棗白蘭地酒醅進行蒸餾后測酒精度,其變化見圖1。酒精含量在發酵過程中呈先增長后逐漸平穩的趨勢。因為在發酵初期,在微生物作用下，酵母利用原料中還原糖進行酒精發酵,產生酒精,隨著發酵進行,酒醅中還原糖和氧氣含量逐漸減少,酒精發酵逐漸停止。

圖1 酒醅發酵過程中酒精度變化Fig.1 Changes of fermented grains’ alcohol degree in fermentation process

圖2 酒醅發酵過程中酸度變化Fig.2 Changes of total acids in fermentation process

2.2 紅棗白蘭地發酵過程中酒醅酸度的變化

對發酵過程中酒醅進行酸度測定,其變化見圖2。酸是形成酒中香味成分的前體物質,也是酒中主要的呈味物質。酒醅在發酵過程中由于各種微生物及酶系的作用,酸度會逐漸上升,在發酵后期,酸度變化逐漸變緩,趨于平穩。

2.3 紅棗白蘭地發酵過程中酒醅氨基酸的變化

用各氨基酸標準溶液的保留時間進行定性,用氨基酸梯度濃度的混合標品進行定量。圖3～圖4分別為氨基酸混合標品和樣品的液相色譜圖。通過對液相色譜圖進行數據分析,得到的樣品中各氨基酸含量變化見表1。

圖3 氨基酸混合標品色譜圖Fig.3 The liquid chromatogram of calibration amino acid mixtures注:1-天冬氨酸；2-谷氨酸；3-組氨酸；4-絲氨酸；5-精氨酸；6-甘氨酸；7-蘇氨酸；8-牛磺酸；9-脯氨酸；10-丙氨酸；11-纈氨酸；12-甲硫氨酸；13-胱氨酸；14-異亮氨酸；15-亮氨酸；16-色氨酸；17-苯丙氨酸；18-賴氨酸;圖4同。

圖4 紅棗白蘭地發酵酒醅氨基酸色譜圖Fig.4 The liquid chromatogram of jujube brandy fermented grains amino acids

由表1可知,在紅棗白蘭地發酵過程中的酒醅氨基酸種類豐富,且隨著發酵時間的變化,氨基酸含量也發生了顯著的變化。其中包含有人體所必需的除色氨酸以外的7種必需氨基酸:賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸。在發酵過程中,含量相對較高的氨基酸為脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸,平均含量分別為39.749、35.477、11.888 mg/g。

表1 紅棗白蘭地發酵過程中酒醅氨基酸含量變化(mg/g)Table 1 Variation of amino acids in fermented grains during jujube brandy fermentation(mg/g)

注:同行上標字母不同表示差異顯著(p<0.05)；表2同。

在酒醅氨基酸中天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、甲硫氨酸含量隨著發酵時間的延長,呈現先減少后增加再減少的趨勢,其中天冬氨酸、組氨酸、甲硫氨酸在發酵結束時的含量低于開始發酵時的含量。谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、賴氨酸含量的變化趨勢相似,呈現先增后減的變化趨勢,但發酵結束時,谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、賴氨酸含量都顯著高于發酵開始時的含量。而纈氨酸則呈現先增后減再增再減的變化趨勢。紅棗白蘭地發酵過程中,釀酒酵母可以利用氨基酸合成蛋白質,用來生長酵母菌體及合成酶類,也可以作為酵母的氮源使用,氨基酸被酵母分解,分子中的氮以氨的形式釋放出來用作合成細胞含氮組織[20]。同時釀酒原料的蛋白質在微生物和酵母的作用下,分解成低分子肽和氨基酸,使酒醅中氨基酸含量增加。脯氨酸和蘇氨酸在發酵過程中基本上不被酵母利用[21],隨著酒精發酵的進行還會生成一定量的脯氨酸和蘇氨酸。苯丙氨酸在發酵過程中呈現先增再減再增的趨勢,且最終含量高于發酵初期。

將酒醅中檢測到的16種氨基酸按照其呈味特征分類,可以分為四類:甜味氨基酸包括絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、脯氨酸、組氨酸;鮮味氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸;苦味氨基酸包括精氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸;芳香氨基酸包括胱氨酸、苯丙氨酸。從呈味特征方面對酒醅氨基酸進行分析,結果見圖5。

圖5 紅棗白蘭地發酵酒醅氨基酸風味分析Fig.5 Flavor amino acid analysis of jujube brandy fermented grains

由圖5可知,在酒醅氨基酸中甜味氨基酸含量最高,其次是鮮味氨基酸、苦味氨基酸、芳香氨基酸。在發酵過程中,甜味氨基酸含量隨發酵時間延長呈增長趨勢,在第4 d達到最高66.695 mg/g;鮮味氨基酸呈現先減后增再減的趨勢,在第3 d含量最高為55.525 mg/g;苦味氨基酸和芳香氨基酸在發酵過程中含量變化不顯著。脯氨酸是紅棗白蘭地發酵酒醅中的主體氨基酸成分,正是由于氨基酸的不同呈味特征及其與醛、酯等其它呈味物質的協同作用,賦予了紅棗白蘭地協調的口感風味[22]。發酵結束時,甜味氨基酸、鮮味氨基酸、苦味氨基酸和芳香氨基酸分別為氨基酸總量的45.39%、35.79%、14.30%、4.52%。氨基酸總含量隨著發酵時間的延長呈現先減后增再減的趨勢,發酵結束時氨基酸總量高于開始發酵時的氨基酸總量。

2.4 紅棗白蘭地發酵過程中酒醅有機酸變化

用各有機酸標準溶液的保留時間進行定性,用有機酸梯度濃度的混合標品進行定量。圖6～圖7分別為有機酸混合標品和樣品有機酸的液相色譜圖。通過對液相色譜圖進行數據分析,得到的樣品中各有機酸含量變化見表2。

圖6 有機酸混合標品色譜圖Fig.6 The liquid chromatogram of calibration organic acid mixtures注:1-草酸；2-酒石酸；3-丙酮酸；4-蘋果酸； 5-乳酸；6-乙酸；7-檸檬酸；8-琥珀酸。

圖7 紅棗白蘭地酒醅有機酸色譜圖Fig.7 The liquid chromatogram of jujube brandy fermented grains organic acids注:2-酒石酸；3-丙酮酸；4-蘋果酸；5-乳酸； 6-乙酸；7-檸檬酸；8-琥珀酸。

表2 紅棗白蘭地發酵過程中酒醅有機酸含量變化(mg/g)Table 2 Variation of organic acids in fermented grains during jujube brandy fermentation(mg/g)

注:上標字母表示同一種有機酸不同發酵時間含量的差異性比較。

“無酸不成味”,酸是酒中重要的一種味感,而有機酸則是酒中酸味的主要來源[23]。有機酸除來自原料以外,還在發酵過程中酵母、霉菌等微生物的代謝作用下產生,如酒精發酵、蘋果乳酸發酵、乙醇的氧化反應等[24]。由表2可知,在紅棗白蘭地發酵酒醅中檢測到的7種有機酸,其中乙酸、蘋果酸、乳酸含量較高,是紅棗白蘭地發酵中的主要有機酸,在發酵后期乙酸含量最高達到8.189 mg/g,其次是蘋果酸含量為4.243 mg/g,乳酸含量為3.646 mg/g。隨著發酵時間的延長,酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸的含量呈現先增后減的趨勢,乙酸的含量一直呈現增長趨勢,檸檬酸含量則是先減少后增加。在酒精發酵開始時,酵母利用多糖產生有機酸,三羧酸循環使檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸發生合成和轉化作用[13];同時琥珀酸是酒精發酵的副產物,所以在發酵結束時琥珀酸的含量較發酵開始時有顯著性提高。乳酸隨著發酵進行,含量先增再減再增,這可能是由于菌株通過己糖-磷酸途徑將生成的5-磷酸-核酮糖裂解為3-磷酸甘油醛,再通過EMP途徑生成丙酮酸并還原為乳酸[25]。

有機酸對酒品發酵過程中的微生物抑制和酒的風味有重要影響,含酸量少的酒,味道寡淡;但如果酸味過大,又會影響酒的風味和品質[26]。比例協調的有機酸能夠抑制雜菌的生長,增強酒的醇厚口感,降低腥甜味,促進芳香酯的形成[27]。其中乳酸酸味柔和醇厚,而且是形成芳香味物質乳酸乙酯的前體物質。乙酸含量少時也能產生愉快的醋香味,為紅棗白蘭地提供良好的風味口感。不同有機酸在酒的風味形成中既發揮各自獨特的作用,又會相互協調,是形成紅棗白蘭地獨特風味的重要成分。

3 結論

本文利用高效液相色譜儀研究了紅棗白蘭地發酵過程酒醅中氨基酸和有機酸含量及發酵過程中酒度、酸度的動態變化。檢測到16種氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)和7種有機酸(酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸)。其中,脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量較高,是紅棗白蘭地發酵產生的的主要氨基酸,發酵過程中平均含量達到39.749、35.477、11.888 mg/g;乙酸、蘋果酸、乳酸含量較高,是紅棗白蘭地發酵中的主要有機酸,在發酵結束時含量分別為8.189、4.243、3.646 mg/g。氨基酸和有機酸作為呈味物質,對紅棗白蘭地的口感和風味有重要的影響,因此研究發酵過程中氨基酸和有機酸的生成機理及動態變化,可以為紅棗白蘭地風味成分的形成機理研究提供理論基礎和實驗依據。

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Variation of amino acids and organic acids in fermented grains during fermentation of jujube brandy

YAN Chao,HOU Li-juan,QI Xiao-ru,ZHAO Huan,WANG Jie*

(Food Science and Technology College,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

The dynamic changes of amino acids and organic acids during grains fermentation of jujube brandy were analyzed with high performance liquid chromatography(HPLC). The results showed that 16 amino acids and 7 organic acids were detected,proline,aspartic acid,glutamic acid showed the highest content and were dominant,the average content in the fermentation process were 39.749,35.477,11.888 mg/g. Acetic acid,malic acid,lactic acid were the main organic acids,the final content were 8.189,4.243,3.646 mg/g. At the end of the fermentation,the summation of amino acids and organic acids revealed a tendency to generally ascend,the amount of sweet amino acids and flavor amino acids were 45.39% and 35.79%,but the proportion of bitter amino acid was smaller. The proportions of amino acids and organic acids made the red jujube brandy a good flavor.

jujube brandy;fermented grains;amino acids;organic acids;dynamic change

2017-01-02

嚴超(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全，E-mail:1970280122@qq.com。

*通訊作者:王頡(1959-)，男，博士，教授，研究方向：棗酒釀造及水產品加工,E-mail:wj591010@163.com。

國家自然科學基金(31371815)。

TS262

A

1002-0306(2017)14-0121-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.024