糖基化反應改善植物蛋白乳濁液穩定性的研究進展

吳周山,陸利霞,2,熊曉輝,2,薛 峰,李 晨,*(.南京工業大學食品與輕工學院,江蘇南京 2800; 2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術服務中心,江蘇南京 20009; .南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 2002)

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糖基化反應改善植物蛋白乳濁液穩定性的研究進展

吳周山1,陸利霞1,2,熊曉輝1,2,薛 峰3,李 晨1,*
(1.南京工業大學食品與輕工學院,江蘇南京 211800; 2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術服務中心,江蘇南京 210009; 3.南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210023)

植物蛋白乳濁液是一種不穩定體系,糖基化反應能夠有效地改善蛋白質乳濁液的穩定性。本文主要介紹了蛋白質糖基化的反應機理,綜述了糖基化反應對大豆蛋白、花生蛋白、燕麥蛋白等各類植物蛋白乳濁液穩定性影響的國內外研究進展,并總結了乳濁液體系穩定性的研究方法。

植物蛋白質,糖基化反應,乳濁液穩定性

植物蛋白是一類來自于植物的蛋白質,富含各種氨基酸。由于其具有豐富的營養和許多優良的功能特性,被廣泛地應用于多種食品中,如肉類食品、焙烤食品、乳制品、飲料等[1]。相對于動物蛋白來說,植物蛋白一般不含或僅含有少量的對人體健康有影響的物質,如膽固醇、油脂、濃縮的荷爾蒙和抗生素等物質。因此,每天攝入一定量的植物蛋白食品代替動物蛋白更符合人類的健康飲食需求,其中植物蛋白飲料由于其營養豐富,口味獨特,且富含各種蛋白質和氨基酸等特點,成為各大賣場的熱銷植物蛋白食品。然而,植物蛋白飲料在生產過程中所形成的植物蛋白乳濁液容易發生油水分離,導致在貯藏過程中會出現蛋白質沉淀和脂肪上浮等現象[2]。為了得到穩定的蛋白乳濁液體系,國內外眾多學者對此進行了深入研究。

通過物理、化學或酶處理等改性方法可以提高蛋白質乳濁液的穩定性[3]。然而,這些方法都存在一些明顯的弊端。物理改性需要依靠外部的機械力,對蛋白的改性方向具有隨機性;大多數的化學修飾存在對人體潛在的健康危害以及破壞產品的外觀從而使其在食品工業中的應用無法推廣;酶處理具有不穩定性以及費用相對較高。近些年來,還有一種我們研究比較多的方法,通過糖基化反應改善蛋白乳濁液的穩定性。糖基化反應是蛋白質熱處理過程中最常見的一種反應,經常發生于蛋白質的儲存過程中,也被稱之為非酶褐變反應[4]。糖基化反應的過程主要是通過共價鍵將蛋白質分子游離的氨基酸或者ε-氨基團與還原糖連接形成糖—蛋白聚合體。與其它改性方法相比,糖基化反應是一種自然發生的反應,無需提供特殊的裝置,具有安全性高、應用前景好等特點,已經被廣泛用來改善蛋白質乳濁液的穩定性[5]。許多學者對大豆蛋白、花生蛋白、燕麥蛋白等植物蛋白質與多糖類化合物經過糖基化反應合成新的蛋白-多糖聚合體進行了研究,結果表明,新合成的糖蛋白的乳化性以及蛋白乳濁液的穩定性都有不同程度的改善。

1 糖基化改性蛋白改善乳狀液穩定性的機理

乳濁液屬于熱力學不穩定體系。在貯藏過程中,乳濁液會出現不穩定現象。引起乳濁液失穩的機制主要包括相轉化、絮凝、聚結、分層、沉降和奧氏熟化。由于乳濁液的熱力學不穩定性,液滴會發生凝聚,從而發生去穩定現象。早期Dickinson和Galazka[6]曾經對糖基化反應改善乳濁液體系的穩定性做出了一些假設:糖基化形成的大分子產物蛋白-多糖聚合體能夠提高乳濁液體系的穩定性主要是由于共聚物結合了蛋白質和糖的一些性質,一方面蛋白質的疏水性能夠使得共聚物緊密的吸附在油-水界面,另一方面多糖的親水性使得共聚物能夠很好地溶解于乳濁液體系中,從而使得共聚物乳濁液體系變得穩定。隨著不斷探索,Dickinson[7]又提出了一些新的觀點:蛋白-多糖聚合體能夠進一步使得蛋白質乳濁液體系變得穩定，主要是因為蛋白質和多糖形成共聚物后能夠控制乳濁液的流變學特性,并且共聚物分子間能夠在連續相中形成網狀空間結構,從而能夠延遲相分離以及由重力引起的乳狀液分層。

當然,也有一些其他的學者對糖基化反應改善乳濁液體系穩定性的機理做出了一些解釋。Liu等[8]認為為了使蛋白質乳濁液體系變得穩定,可以通過糖基化反應形成蛋白-多糖聚合體以降低其乳濁液體系的界面張力,形成穩定的界面膜。Yaday和Chen[9-10]具有相似的觀點:乳濁液體系中,當多糖分子吸附在蛋白質上形成蛋白-多糖聚合體后能夠在乳濁液中的液滴表面形成一個厚的保護膜,從而抑制了乳濁液體系中的液滴之間發生沉淀、絮凝和聚集等現象,使得乳濁液體系變得穩定。

通常當蛋白質處于pH為等電點的環境下會發生聚集沉淀現象。而Wong等[11]通過將可溶性小麥分離蛋白(sIWP)、可溶性小麥分離蛋白和分子質量為9～11 kDa的葡萄聚糖反應形成的蛋白-多糖聚合體(sIWP-D10)、可溶性小麥分離蛋白和分子質量為64～76 kDa的葡萄聚糖反應形成的蛋白-多糖聚合體(sIWP-D65)在pH4和pH7的環境下的穩定性進行了測試。結果顯示在pH7時三者都能保持穩定,pH4時,IWP發生聚集沉淀現象,IWP-D10相對較穩定沒有發現明顯沉淀和聚集現象,而IWP-D65能夠保持穩定(見圖1)。在pH4時,由于IWP的離子缺失以及空間結構的破壞使得蛋白質分子出現了絮凝現象;對于IWP-D10,由于N末端蛋白質擴散層的破壞使得共軛的D10葡萄聚糖分子的暴露,而D10葡萄聚糖能夠提供一個物理屏障抑制了乳濁液的絮凝;對于IWP-D65,在pH7時D65葡萄聚糖共軛物的N末端能夠額外形成一個大約5.9 nm厚的碳水化合物空間層位于乳濁液界面使得體系變得穩定,在pH4時,D65葡萄聚糖可以提供一個更加穩定的空間屏障來保護乳濁液的穩定性。

圖1 sIWP,sIWP-D10聚合體,sIWP-D65聚合體在pH4和pH7環境下的穩定機理[12]Fig.1 The stability mechanism of sIWP,sIWP-D10 polymers, sIWP-D65 polymers in the environment of pH4 and pH7[12]

2 各類植物蛋白糖基化改性后對乳狀液穩定性的影響

2.1 大豆蛋白

大豆蛋白與牛奶蛋白有相近的氨基酸組成。在營養價值上,可與動物蛋白等同,在基因結構上也最接近人體氨基酸,因此被視之為最具營養的植物蛋白。大豆蛋白本身就具有一定的乳化性,如在羅非魚蛋白中添加大豆蛋白形成的羅非魚-大豆蛋白共沉淀物,較之單純的羅非魚蛋白的乳化性,共沉淀物的乳化性有了明顯的提高[13];在冰淇淋中添加部分大豆分離蛋白,其組織形態完整,無粗糙感[14]。但由于單純的大豆蛋白結構具有不穩定性,其功能特性在實際應用中隨著加工條件的改變而發生變化,使得大豆蛋白的應用范圍得到了一定的限制。通過糖基化反應能夠改善大豆蛋白的乳濁液性質,能夠使大豆蛋白的應用界限得以一定程度的拓寬。表1列舉了不同研究人員對大豆蛋白的糖基化改性的實驗內容及實驗結果。

表1 不同研究人員對大豆蛋白的糖基化改性的實驗內容及結果Table 1 The experiment content and results of different researchers on the glycosylation of soybean protein

表2 不同研究人員對花生蛋白的糖基化改性的實驗內容及結果Table 2 The experiment content and results of different researchers on the glycosylation of peanut protein

2.2 花生蛋白

花生中含有25%～36%的蛋白質,其中大約有10%的蛋白質是水溶性蛋白,又稱為乳清蛋白,其余90%為鹽溶性蛋白。花生蛋白與大豆蛋白相比,具有易消化、無豆腥味等優點,同樣也是一種營養價值較高的植物蛋白,含有人體所需的八種必須氨基酸。花生蛋白乳濁液的不穩定性限制了其在食品工業中的應用。

經研究,發現多糖蛋白之間的相互作用可以影響蛋白的功能特性,其中乳化性也會隨之改變。在食品工業中,人們常常利用這種特性來提高花生蛋白乳濁液的穩定性。表2列舉了不同研究人員對花生蛋白的糖基化改性的實驗內容及實驗。

2.3 燕麥蛋白

燕麥是一種特色的雜糧作物,富含蛋白質、脂肪、膳食纖維等營養素。1997年美國FDA認定燕麥為功能性食物,具有降低膽固醇、平穩血糖的功效。美國《時代》雜志評選的“全球十大健康食物”中燕麥位列第五,是唯一上榜的谷類。燕麥中含有大約16%的蛋白質,其中球蛋白占50%左右。球蛋白是一種在三級結構上與大豆球蛋白相似的蛋白質[22]。因此,燕麥蛋白受到了人們的廣泛關注。為了提高其應用前景,有研究者利用糖基化反應對其進行了改性研究。

Zhang B等[23]利用木糖、葡萄糖、乳糖、20 ku葡聚糖和40 ku葡聚糖與燕麥蛋白在90 ℃、pH9的反應條件下進行糖基化反應,然后對反應產物的功能性質進行研究,結果表明:葡萄糖與燕麥分離蛋白的糖基化產物溶解度大幅提高,多糖特別是40 ku葡聚糖與燕麥分離蛋白生成的糖基化產物具有較高的乳化活性和乳化穩定性。陳世超等[24]以燕麥蛋白作為研究對象,通過改變反應條件,對燕麥蛋白-葡萄聚糖進行濕熱復合改性,發現反應物以質量比為1∶1,在100 ℃、pH9的反應環境下反應120 min,改性后的蛋白以多糖聚合體的功能性質最佳,溶解性提高到了82%,乳化性和乳化穩定性得到了顯著提高。

2.4 其它植物蛋白

Horax R等[25]對成熟的苦瓜種子中的蛋白質(BMSPI)進行了糖基化改性研究,結果表明:糖基化產物具有良好的乳化特性,并能夠很大程度地提BMSPI乳濁液穩定性。

DU Y等[26]以K-卡拉膠作為糖基供體,將大米渣滓谷蛋白與K-卡拉膠以1∶2的質量比進行美拉德反應,對反應產物功能性質進行研究,結果表明:K-卡拉膠-大米渣滓谷蛋白聚合體乳濁液的穩定性得到了一定程度的提高,能夠適應低pH和高離子強度的環境。

3 乳濁液體系穩定性的研究方法

目前,對于乳濁液體系的穩定性的研究主要是通過測定乳濁液體系的濁度、粒徑大小、粒徑分布以及動態流變等參數來確定的。常見的方法主要有透射光濁度法、粒度分析儀法、乳濁液比例分析法等。

3.1 透射光濁度法

透射光濁度法是利用濁度計對乳濁液的濁度進行測量,通過觀察光透過乳濁液時的透過率的變化來確定乳濁液內部顆粒大小的變化[27]。Jing H等[28]對蛋清蛋白和果糖進行糖基化反應,利用濁度法來判斷蛋清蛋白糖基化反應前后的乳濁液體系穩定性,結果表明:糖基化產物的乳濁液體系在相同時間內較反應前的蛋白乳濁液體系的濁度變化并不明顯,可以看出糖基化反應后的產物乳濁液體系在一定時間內更趨于穩定。Chen H Y等[29]在研究糖基化反應改善卵黃高磷蛋白乳濁液穩定性的實驗中也用到了濁度法,利用分光光度計在500 nm處對乳濁液體系測量獲得數據來表示乳濁液體系的穩定性,數據顯示卵黃高磷蛋白和葡萄聚糖的糖基化產物的乳濁液體系不僅較單純的卵黃高磷蛋白的乳濁液體系穩定,并且能夠在酸性環境下具有較高的穩定性。

除了可以直接測量乳濁液體系的濁度,也可以測量乳濁液體系的濁度半衰期。Hashemi等[30]在研究溶菌酶素和黃原膠的糖基化產物的功能性質時,利用濁度法對溶菌酶素-黃原膠共價聚合物的乳濁液穩定性改善情況進行描述,發現溶菌霉素-黃原膠共價聚合物乳濁液的濁度半衰期較單純的溶菌酶素的乳濁液的濁度半衰期有明顯的延長,可以看出糖基化反應對于溶菌霉素的乳濁液穩定性有一定的改善。

3.2 粒度分析儀法

粒度分析儀法是通過粒度分析儀來測定乳濁液體系中的分子粒度,以及乳濁液顆粒平均粒徑的變化來確定乳狀液的穩定性[31]。

Dunlap[32]在研究多糖的大小對乳濁液穩定性影響的實驗中,通過粒度分析法對β-乳球蛋白-多糖共價聚合物的乳濁液體系以及β-乳球蛋白乳濁液體系的粒度平均直徑大小來判斷乳濁液體系穩定性差別,結果發現:單純的β-乳球蛋白乳濁液體系的粒度平均直徑在90 d之內隨著時間的變化發生了明顯的變化,而β-乳球蛋白和一定大小分子質量的多糖共價聚合物的乳濁液體系的粒度平均直徑隨著時間的變化并未發生明顯的變化。Bi B W等[33]對β-乳球蛋白和塞雅阿拉伯樹膠(ASY)糖基化反應的共聚物的乳濁液性質進行了研究,實驗過程中將純的塞雅阿拉伯樹膠和糖基化不同反應時間下形成的共價聚合物的乳濁液在經過加速度操作后對乳濁液的穩定性進行了測試并利用粒度分析儀測量乳濁液的粒度平均直徑,結果發現:在7 d儲存過程中,單純的ASY的粒度直徑從10 μm變成了57 μm,糖基化反應時間在12 h之內的糖基化共價聚合物的乳濁液體系的粒度直徑有小幅度的變化,而反應時間超過12 h的糖基化共價聚合物的乳濁液體系的粒度能夠保持穩定,沒有發生明顯變化。

3.3 乳濁液比例分析法

乳濁液比例分析法較之透射光濁度法和粒度分析儀法,具有準確、簡便、儀器依賴性不強等特點。因此在對乳濁液穩定性評估過程中也經常被采用。

Zhang J B等[34]以麥芽糖糊精作為糖基和大豆分離蛋白發生糖基化反應,對產生的共價聚合物的乳濁液性質進行了測定,通過將10 mL乳濁液樣品放置于高140 mm內直徑15 mm的玻璃管中儲存2個月,隨后對樣品乳濁液穩定性進行測量,將CI(%)=(Hsl/HT)×100(Hsl:乳濁液乳清高度;HT:乳濁液總高度)作為評判乳濁液穩定性的標準,當CI越小,說明乳濁液體系越穩定。在實驗過程中為了節省時間,時浩等[35]在乳濁液穩定性判定過程中,通過先將乳濁液進行離心,乳濁液若分層,將上層高度記為h,下層高度記為H,利用h/H的大小來判斷乳濁液的穩定性,認為當h/H小于0.07時,乳濁液是穩定的。

3.4 其它研究方法

透射光濁度法、粒度分析法和乳濁液比例分析法是目前人們對乳濁液體系穩定性判定常用的方法。當兩種乳濁液進行對比時,也可以通過直接觀察法來判定乳濁液的穩定性。

César等[36]研究植物蛋白和多糖對乳濁液的影響,發現大豆可溶性多糖和大豆分離蛋白的混合乳濁液在中性pH和pH為3～4的環境下儲存15 d后保持穩定,而果膠和大豆分離蛋白的混合乳濁液在同樣的環境下發生了絮凝和液滴聚集等不穩定現象。

4 蛋白-多糖共價復合物乳濁液的潛在應用

蛋白-多糖共價復合物乳濁液具有較好的乳化性以及穩定性。蛋白多糖共價復合物能夠使油珠變得穩定避免其由于外界環境影響,如pH、鹽、冷凍、脫水和機械攪拌,發生聚集現象。另外,具有生物活性的親油性化合物也能通過在其內部油相中加入蛋白-多糖乳濁液使其和其它水溶性成份分隔開從而將其保護起來免受外界環境影響,避免發生化學降解。基于這些性質,蛋白-多糖共價復合物乳濁液在食品產業、醫藥和化妝品領域有很多潛在的應用價值[37]。

在食品產業中蛋白-多糖共價復合物乳濁液一方面能夠提高乳化性,另一方面也可為其提供保護機制。對于一些富含多元不飽和脂肪酸的油類,由于其具有低溶解性以及容易發生氧化等特點,使它們的應用受到了很大的限制。我們可以通過豌豆分離蛋白和果膠反應制成乳化劑,然后通過噴霧干燥進行微囊化加入到這些食品中將這些問題得到解決[38]。能夠通過控制蛋白-多糖乳濁液中油滴的表面電荷和厚度來將油滴內部環境和外面分隔開,以此來將油滴內部物質和外面環境之間的相互作用降到最小,從而使得和蛋白-多糖乳濁液混合的物質變得更加穩定。如,在ω-3脂肪酸中加入蛋白-多糖乳濁液可以提高其抗氧化性[39]。一些親脂性脂肪酸化合物,如,類胡蘿卜素、維生素類和一些風味調料,也可以通過這種方法來提高化學穩定性[40-41]。

在醫藥中,我們可以看到各種藥品在臨床上使用,然而有一部分具有很好醫療效果的物質由于在水中具有低溶解性而未能在臨床上見到。我們可以通過在這些物質中加入蛋白-多糖共價復合物乳濁液來改善其溶解性,并使其變得更加穩定。另外,也可以結合微膠囊技術,將蛋白-多糖公共價復合物乳濁液作為壁材來對藥物進行包埋。通過變化微膠囊壁的厚度來控制藥物釋放的速度并對藥物進行保護,免受外界環境影響[42]。但是,這一技術并未成熟,微膠囊壁材的選取,以及微膠囊壁厚度的控制等問題都需要我們去解決。

在化妝品領域,隨著人們生活水平的提高,人們對于皮膚的保養看得越來越重。化妝品中的護膚品大都是乳液形式。但大部分護膚品都存在保存時間較短、不易被皮膚吸收達不到很好的護膚效果等問題。根據蛋白-多糖共價復合物乳濁液的高乳化性以及穩定性,或許我們能夠在護膚品中添加蛋白-多糖乳濁液來解決這種問題。另外,植物蛋白和多糖都可做為天然產物,它們的共價復合物蛋白-多糖乳濁液可以作為一種綠色物質做為護膚品的選材。

5 結語

糖基化反應能夠在一定程度上有效地改善植物蛋白質乳濁液的穩定性,為植物蛋白質乳濁液在食品、醫藥、化工等領域 的有效應用提供了廣泛的可能性。但關于糖基化過程中存在的一些問題,如糖基供體的選擇、糖基化反應條件的優化以及糖基化改性機理等仍需要我們進一步去研究和探討。

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Research progress of glycosylation reaction to improve plant protein emulsion stability

WU Zhou-shan1,LU Li-xia1,2,XIONG Xiao-hui1,2,XUE Feng3,LI Chen1,*

(1.College of Food and Light Industry,Nanjing University of Technology,Nanjing 211800,China; 2.Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety,Nanjing 210009,China; 3.College of Pharmacy,Nanjin University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China.)

Vegetable protein emulsion was an unstable system,and the emulsifying properties could be effectively improved by the protein glycosylation reaction. In this paper,the mechanism of glycosylation reaction was introduced,and the effects of glycosylation were reviewed domestic and overseas on functional properties of protein emulsion such as soy protein,peanut protein,oat protein and other kinds of vegetable protein,and meanwhile the methods for emulsion system stability were summarized.

vegetable protein;glycosylation reaction;stability of emulsion

2017-02-13

吳周山(1993-)，男，碩士，研究方向：食品化學，E-mail：wuzhoushan@njtech.edu.cn。

*通訊作者:李晨(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品化學，E-mail：lichenfs@njtech.edu.cn。

江蘇省自然科學基金青年基金項目(BK20150950)；國家自然科學基金青年科學基金項目(31501529)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)14-0336-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.066